C1q/TNFα相关蛋白-2球状功能区的表达、纯化及活性分析

李洪波，胡 兴，李 娜，吴东海

（1.怀化学院生命科学系，民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418008；2.中国科学院广州生物医药与健康研究院，广东广州 510530）

C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白（C1q and tumor necrosis factor related protein，CTRP）是一类与脂联素在结构和功能上极为类似的蛋白。这些蛋白与脂联素非常相似，一般由4个不同结构域组成：N-末端的信号肽、短的可变结构域、胶原结构域和1个与补体蛋白C1q同源的C-末端的球形结构域，C-末端的球形区是其功能区［1］。在已发现的CTRPs中，CTRP2与脂联素的功能最为相似，CTRP2能快速激活AMPK、ACC及p44/42 MAPK的磷酸化信号通路；CTRP2球状结构域（gCTRP2）具有增加肝脏糖原合成、促进脂肪酸的氧化及胰岛素增敏作用。CTRPs作用机制的研究主要是利用其球状功能区蛋白［1－3］。重组全长hCTRP2蛋白已在大肠杆菌中和酵母中实现活性表达［4－5］，本研究将以大肠杆菌为宿主菌，制备重组hCTRP2的球状功能区蛋白（gH2），并对其活性进行分析。

1 材料

表达菌株 BL21-codonplus（DE3）、表达载体pET32a（＋）购自Invitrogen公司。镍亲和层析树脂购自Qiagen公司，分子筛Sephadex G-75购自于GE公司，抗体均购自于CST公司。8周龄的C57BL/6♂小鼠由中国科学院广州生物医药与健康研究院实验动物中心饲养。

2 方法

2.1 表达载体构建及表达产物的验证设计上游引物PF（5′-3′）：5′-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTA C-3′（GGATCC BamHI位 点）；下 游 引 物 PR（5′-3′）：5′-GCCTCGAGTCAGATTAGGAAGCCCGTAAA G-3′（CTCGAG XhoI位点）；PCR扩增目标基因并构建重组载体pET32/gH2转化大肠杆菌BL21-codonplus（DE3）菌株。随机挑取数个转化子单菌落，接种至20ml含50 g·L－1Amp LB液体培养基的50 ml三角瓶中，37℃、250 r·min－1培养至 A600＝0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.2mmol·L－1，20℃诱导3 h，取菌液2 ml，离心得菌体，向菌体中加入含1%曲拉通X-100、3mmol·L－1PMSF的PBS溶液200μl，超声破碎，离心取上清80 μl，向其中加入20μl5×SDS-PAGE上样缓冲液，加热变性，SDS-PAGE分析目标蛋白的可溶性表达情况。

2.2 重组蛋白纯化取种子菌液1 ml，接种至200 m l抗性LB液体培养基中，37℃、250 r·min－1培养至 A600＝0.6～0.8，于20℃诱导5 h，离心取菌体。镍亲合纯化参照精编分子生物学实验指南和文献进行［5－6］。将镍亲合纯化后的蛋白利用曲拉通X-114去除内毒素并浓缩，Superdex G-75分子筛纯化，具体步骤参照文献进行［7］。取不同咪唑浓度的蛋白洗脱液和经分子筛纯化收集的蛋白，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液、经煮沸变性后，15%SDS-PAGE分析纯化情况，利用已制备的hCTRP2C-端特异体对蛋白进行Western blot验证［8］。Trx（硫氧还蛋白）的表达与纯化参照文献进行［4］。

2.3 重组蛋白活性分析C2C12于5%胎牛血清中培养至90%细胞密度，2%马血清的DMEM培养基分化培养6 d，无血清饥饿12 h，加入终浓度为1 mg·L－1Trx-gH2蛋白温育不同时间，RIPA裂解细胞，离心收集蛋白上清，12%SDSPAGE分离蛋白，转膜并利用相应抗体对相应信号通路蛋白进行Western blot分析。

C57BL/6小鼠实验操作严格按照动物委员会的相关规定开展。实验小鼠在实验前先测定其基础血糖浓度；之后，按2μg·g－1体重腹腔注射15只经12 h饥饿的8周龄♂小鼠，尾静脉取血10μl，测定注射后0－5 h的血糖浓度；同时，设注射Trx的对照实验小鼠15只（2μg·g－1体重）。

3 结果

3.1 载体构建及表达产物验证pET32/gH2重组载体测序表明质粒构建正确。重组大肠杆菌转化子经IPTG诱导前后的SDS-PAGE结果如Fig 1所示，可以看出，未经IPTG诱导重组载体BL21转化子（泳道6）在35 ku的位置没有出现明显的特异表达产物，而5株经IPTG诱导的重组载体的BL21转化子（泳道1－5）在35 ku有明显的蛋白表达（箭头所示），该蛋白的分子质量大小与预期分子质量相符。

Fig 1 SDS-PAGE identification of the expression of Trx-gH2

3.2 重组蛋白的纯化SDS-PAGE分析结果表明，利用含40 mmol·L－1咪唑的漂洗缓冲液几乎不能将目标蛋白从镍亲合层析柱上洗下；当咪唑为100 mmol·L－1时，目标蛋白的纯度最高；当咪唑浓度为200和300 mmol·L－1时目标蛋白被大量洗脱但有少量杂蛋白（Fig 2-A）。将100 mmol·L－1咪唑洗脱的蛋白样品收集，曲拉通X-114除去内毒素后透析、超滤浓缩，再利用Sephadex G-75分子筛对重组蛋白进一步纯化，分子筛纯化蛋白的洗脱曲线如Fig 2-B所示。洗脱曲线第1个峰的1－5号蛋白样品经SDS-PAGE分析，结果如Fig 2-C所示，该蛋白在SDS-PAGE结果中看不到明显杂蛋白条带。利用hCTRP2的C-端特异性抗体对该蛋白进行了Western blot分析，结果如Fig 2-D所示，Western blot结果表明，蛋白洗脱曲线峰1的蛋白是Trx-gH2蛋白。

3.3 活性分析细胞信号转导的Western blot结果如Fig 3A所示，经2 mg·L－1的Trx-gH2刺激5 min，可以检测到磷酸化ACC较刺激前加强；刺激细胞10 min，ACC磷酸化程度有明显增强；当刺激细胞达30 min，ACC磷酸化的增加更为明显。由于Trx不能激活ACC的磷酸化［4］，细胞刺激实验表明，大肠杆菌表达的融合蛋白Trx-gH2具有生物活性。降血糖活性测定结果表明：在注射前，两组小鼠的血糖水平没有明显差异；在注射1 h后，注射Trx-gH2小鼠的血糖要明显低于注射Trx的对照小鼠，在注射2 h后两者之间存在明显差异；在注射后的1～4 h内，注射Trx-gH2的实验组小鼠的血糖都要明显低于注射Trx的对照组小鼠，但注射后5 h，两实验组小鼠的血糖差异消失（Fig 3B）。动物实验结果证明，利用大肠杆菌表达系统生产的Trx-gH2蛋白具有降血糖活性。

4 讨论

Fig 2 Purification and identification of fusion recombinant protein of Trx-gH2

Fig 3 Biological activity assays of purified fusion recombinant protein Trx-gH2

利用酵母表达系统和大肠杆菌表达系统对hCTRP2的全长蛋白进行了表达，在酵母表达系统中，重组蛋白被酵母自身分泌的Yapsin蛋白酶降解，因而分泌的hCTRP2蛋白被立即切割成分子量大小不同的片段［4－5，9］；pET32为表达载体，实现了全长hCTRP2在大肠杆菌中的可溶性融合表达，其表达产物具有生物活性。hCTRP2的球状区是其功能区，目前在对CTRPs蛋白的功能和作用机制研究时主要利用其球状功能区蛋白。Lee等［10］将hCTRP6与GST融合，也实现了hCTRP6球状区的可溶表达，但其表达量很低［10］。虽然GST标签也可增加一些重组蛋白的可溶性表达，但对于CTRPs蛋白，GST标签不能有效地增加CTRPs蛋白的可溶性表达。本研究最后以N端融合有Trx-tag的pET-32a（＋）为表达载体，实现hCTRP2球状区蛋白的高效可溶表达。与酵母表达系统相比，大肠杆菌表达的Trx-gH2没有出现产物降解现象，说明CTRP2在大肠杆菌表达系统中的稳定性要比酵母高。

在细胞刺激实验时，Trx-gH2和酵母表达的hCTRP2一样，有激活ACC磷酸化的作用，在重组蛋白刺激细胞5 min后都能检测到磷酸化水平的增加［5］；在检测动物水平的降血糖活性时，酵母表达的全长hCTRP2在注射小鼠1 h时的降血糖活性并不明显［5］，而注射Trx-gH2蛋白在注射1 h后呈现出降血糖活性，说明Trx-gH2蛋白在动物水平上的活性出现得似乎更快一些；注射酵母表达的hCTRP2的降血糖活性可以维持至少7 h［5］，而注射Trx-gH2 5 h后，其降血糖活性消失。由于Trx-gH2蛋白融合了Trx片段，虽然注射的蛋白质量相同，但与酵母表达的hCTRP2相比，Trx-gH2蛋白质分子要少，因此出现Trx-gH2降血糖持续活性不如酵母表达的全长hCTRP2。总之，本研究为hCTRP2或相似蛋白的可溶、稳定和活性表达找到了一种高效的蛋白表达系统和纯化方法。

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