三七花总皂苷对大鼠离体胸主动脉的舒张作用及其机制

王 政，蒋嘉烨，可 燕，江永波，魏 莉，王佑华

（1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

三七花蕾是五加科植物三七（Panax Notoginseng（Burk）F.H.Chen）的干燥花（Flower buds of Panaxnotoginseng（Burk）F.H.Chen）。主产于云南文山。《本草纲目拾遗》中说：“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参、三七为中药之最珍贵者。”而三七花是三七全株中皂苷含量最高的部分［1－3］。具有清热解毒、平肝明目、生津止渴、降压等药理［4］作用，具有抗炎、镇痛、降血压、镇静、活血化瘀、增强人体免疫力功能等功效［5］。

血管疾病（diseases of blood vessel）目前是影响人类健康的主要疾病之一［6－8］，导致血管产生疾病的原因多样，其中大部分是由于病变使管腔狭窄，继而发生受供器官或肢体的缺血以至坏死［9－10］，而三七花在针对血管疾病方面，如高血压［12］、动脉粥样硬化［11］、促血管新生［13］等方面具有一定的优势，文章从血管疾病原理出发，发现三七花总皂苷对离体血管有一定的舒张作用，结合不同抑制剂阐述其可能机制。

1 材料

1.1 试剂与仪器三七花（云南文山三七科技创新中心有限公司）；乙酰胆碱（ACh），批号：A2661-25G，Sigma；苯肾上腺素（phenylephrine，PE），批号：P6126-5G；五羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），批号：H9523-25MG，Sigma；左旋硝基精氨酸甲酯（LNAME），批号：561334A，Sigma；吲哚美辛（indomethacin），批号：51298-62-5，Adamas Reagent；亚甲蓝（Methylene blue），批号：61-73-4，Adamas Reagent；Triton X-100；PawerLab血管功能测定系统（澳大利亚 AD INSTRUMENTS）；4通道（6ml水浴槽）多功能生理记录仪（澳大利亚AD INSTRUMENTS）；Agilent 1100 Series；电子分析天平（Sartorius CPA225D）；旋转蒸发仪（BUCHIB49）；L-120042超声清洗仪等。

1.2 动物SD大鼠，（200±20）g，♂，购于上海中医药大学实验动物中心。

2 方法

2.1 三七花总皂苷制备取三七花100 g，加6倍70%乙醇回流提取两次，减压回收乙醇，浓缩所得浸膏加水溶解，大孔吸附树脂D101进行纯化，D941离子树脂法进行脱色，得到三七花总皂苷，Agilent 1100 Series进行皂苷成分检测。

2.2 血管环的制备大鼠麻醉处死，迅速取出整体胸主动脉部位，置于4℃，含95%O2和5%CO2混合气体预饱和的K-H液中，分离胸动脉剔出周围脂肪组织制成3 mm血管环，将血管环固定于6 ml K-H液的浴槽内，37℃恒温，并持续通人95%O2＋5%CO2的混合气体。每个血管环给予2.0 g拉力，每20 min更换K-H液1次，平衡80 min，以60 mmol·L－1的KCl预收缩两次，以诱发最大收缩度，用K-H液洗脱拉力稳定后，第1次加入5-HT 20μmol·L－1，待拉力达坪值后加入10μmol·L－1ACh，若血管舒张达80% 以上，可认为内皮完整。内皮检查完整度后，使用K-H液洗脱拉力稳定后，第2次使用10μmol·L－1PE，待拉力稳定后加入目标药物，检测药物对血管环的作用（皂苷浓度均为20 g·L－1）；去内皮血管环的制备选用Triton X-100 0.1%溶液给血管环灌注10 s中，使用K-H液冲洗干净即可，内皮检查使用乙酰胆碱舒张度小于20%即可。

2.3 观察累计剂量的三七花总皂苷对基础状态血管环的影响将内皮完整的SD大鼠胸主动脉血管环随机分为：三七花总皂苷组、对照组。以不同累计剂量作用于基础状态，实验组（n＝6）与对照组（n＝6）采用累计剂量，使终浓度达到 1×10－5、2×10－5、5×10－5、1×10－4、2×10－4g·L－1，每 1 min加 1次，对照组以蒸馏水代替皂苷加入量。

2．4 累计剂量三七花总皂苷对高K＋预收缩血管环的影响分组及加药方法同“3.3”，实验组（n＝6）以不同累计剂量皂苷作用于60 mmol·L－1的KCl预收缩的血管环，观察三七花总皂苷对血管环的影响。对照组加入相同剂量的蒸馏水。

2．5 累计剂量三七花总皂苷对PE预收缩内皮完整与去内皮血管环的影响分组及加药方法同“3.3”，实验组（n＝6）以不同累计剂量皂苷作用于10 μmol·L－1，PE预收缩的血管环，观察三七花总皂苷对血管环的影响。对照组加入相同剂量的蒸馏水。

2.6 三七花总皂苷对无钙液预处理的的去内皮血管环的作用实验组（n＝6）将血管使用机械力取出血管内皮细胞，然后在无钙液中稳定40 min，加入皂苷2×10－4g·L－1共孵育20 min，加入10μmol·L－1，苯肾上腺素PE预收缩的血管环，观察皂苷的作用，对照组加入相同剂量K-H液。

2．7 观察皂苷对L-NAME/吲哚美辛预处理的PE预收缩的影响实验组（n＝6）用L-ANME/吲哚美辛浓度为0.1 mmol·L－1孵育内皮完整的血管环20 min，以PE预收缩，观察皂苷的作用，对照组加入相同剂量K-H液。

2.8 统计学处理所有计量资料用±s表示，应用SPSS 18.0统计软件进行分析，两组之间比较使用t检验，多组间使用不同组间的方差分析进行比较（LSD，SNK）。

3 结果

3．1 三七花总皂苷鉴定Agilent1100液相色谱条件：流动相：进行梯度洗脱，梯度为乙腈A-水B（0～10 min，20% ～30%A；20～30 min，30% ～35%A；30～40 min，35% ～40%A；40～50 min，40% ～50%A；50～60 min，50% ～60%A），检测波长：203 nm，流速：1 ml·min－1，柱温：25℃，进样量：20μl。三七花总皂苷指纹图谱如Fig 1B，三七花主要由三七皂苷 R1、L、K，人参皂苷 Re、Rg1、Ra3［20－（S）原人参三醇型皂苷］，人参皂苷 Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rc［20－（S）原人参二醇型皂苷］；A为不同的皂苷标准品指纹图谱。

3.2 观察累计剂量的三七花总皂苷对基础状态血管环的影响累计剂量的三七花总皂苷对基础状态的血管环无影响，P＞0.05，差异无统计学意义。

Fig 1 Fingerprint of the total saponin extract from flowers of Panax notoginseng

3．3 累计剂量三七花总皂苷对高K＋预收缩血管环的影响见Fig 2，三七花总皂苷浓度为20 g·L－1，累计剂量的三七花总皂苷对高K＋预收缩血管环有影响，使终浓度达到 1×10－5、2×10－5、5×10－5、1×10－4、2×10－4g·L－1，各累计剂量之间对血管环的影响有统计学意义（P＜0.05），以高钾收缩为100%，累计 2×10－4g·L－1最大舒张率可达23.6%，与对照组A相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。

Fig 2 Cumulative dose of saponins on high K＋pre-contracted artery rings

3．4 累计剂量三七花总皂苷对PE预收缩内皮完整与去内皮血管环的影响见Fig 3，累计剂量的三七花总皂苷对PE预收缩内皮完整血管环有明显影响，相对比于空白对照组A，差异具有统计学意义（P＜0.01），各累计剂量之间对血管环的影响有差异（P＜0.01），以PE收缩度为100%，三七花最大舒张率可达55.51%。而去内皮血管环与对照组A1无差异（P＞0.05），说明三七花总皂苷对内皮血管环没有舒张作用，内皮完整相比去内皮血管环差异有明显的统计学意义（P＜0.01）。

3.5 三七皂苷对无钙液预处理的的去内皮血管环的作用见Fig 4，观察无钙液与皂苷培育的血管环对PE预收缩有明显的收缩抑制作用，差异有统计学意义，（P＜0.01）。以PE收缩度为100%，三七花B组抑制最明显最大收缩率仅为5%（P＜0.05）。

Fig 3 Cumulative dose of saponins on PE pre-contracted artery rings（Endothelial and Endothelium）

Fig 4 Effect of notoginsenoside on vascular ringswithout endothelium pretreated by calcium-free solution

3．6 观察皂苷对L-NAME/吲哚美辛预处理的PE预收缩的影响见Fig 5，与对照组相比，实验组加入的皂苷对L-NAME预处理的PE预收缩有明显的抑制皂苷的舒张作用（P＜0.01，B1vsB11），各累计剂量之间对血管环的影响有差异性（P＜0.05）。见Fig 6，实验组加入的皂苷对吲哚美辛预处理的PE预收缩的血管环有明显的抑制舒张作用，各组别之间差异有统计学意义（P＜0.05，B1vsB11）。

4 讨论

Fig 5，6 Saponins on PE pre-contraction pretreated by L-NAME and indomethacin

舒张血管［14－15］作用途径总的来说，主要通过内皮依耐性增加舒血管活性物质NO及前列腺素的释放，抑制缩血管物质如内皮素等的产生，非内皮途径阻滞钙离子通道、开放钾离子通道等途径发挥舒张血管的作用。本文中主要采用高浓度K＋溶液与PE使血管进行预收缩，高K＋溶液是引起细胞外钙离子内流主要通过电压门控钙通道（voltage-dependent channel，VDC）的开放，它的开放主要是由于细胞膜的除极或者细胞外液中的K＋浓度的升高。实验中发现累计剂量的三七花皂苷对高K＋预收缩血管环有明显舒张作用，最大舒张率可达23.6%；PE是受体控制性钙通道（receptor-operate cannel，ROC），ROC的开放与膜的去极化无关，主要是与细胞膜上存在的特异性受体蛋白有关，当给予PE刺激后与相应受体结合，引起细胞质内钙离子浓度升高产生的收缩。实验中累计剂量的三七花总皂苷对PE预收缩血管环有明显影响，最大舒张率可达55.51%。一般引起大鼠离体血管环的舒张作用主要有两个途径：内皮依耐性舒张和非内皮依耐性舒张。非内皮依耐性舒张主要与Ca2＋离子通道的激活有关，它的激活可以使细胞质内的钙离子浓度升高，而引起的血管收缩与舒张，实验证明三七花没有非内皮依耐舒张作用。根据其作用方式可以分为影响钙内流的钙通道和影响内钙储库释放的钙通道。另一种途径是内皮依耐性血管舒张，引起此种舒张主要是由于胸主动脉血管产生内皮源性舒张因子NO［16］和前列腺素类物质 （prostacyclin）［17］扩散到血管中去引起的舒张。通过使用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME孵育血管环，环氧合酶抑制剂吲哚美辛孵育血管环实验可以看出三七花主要是通过刺激内皮细胞产生一氧化氮合酶和环氧合酶引起了血管的舒张。进一步详细机制研究在进行中。

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