大孔吸附树脂对金银花多糖脱色工艺研究

何俊婷

(陕西新药技术开发中心，陕西西安 710075)

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或初开的花。金银花多糖是从金银花中提取的结构复杂的大分子化合物。药理研究表明，金银花多糖具有显著的免疫增强作用、抗氧化活性及一定的抗菌作用［1-3］。采用水提醇沉法得到的金银花粗多糖含杂质较多，颜色深，给其深入研究及产品开发带来了困难，必须对粗提物进行进一步纯化。而粗多糖的纯化要经历的脱蛋白及脱色素工艺要使用大量的有机溶剂，工艺复杂繁琐，成本高，造成环境污染。

大孔树脂广泛用于中草药有效成分的分离、纯化，其具有表面积大、孔隙率大、机械强度高、热稳定性好、交换速率快的特点。采用大孔树脂法进行多糖脱色，具有脱色率高、多糖保留率高的优点。

本文采用大孔吸附树脂纯化金银花多糖，通过响应面法优化工艺条件，为制备高纯度的金银花多糖奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

金银花，采收于山东平邑县;LS-206、LS-46、LS-30、AB-8、D941、LXD-762、LSA-700、LSA-700B 型树脂;无水葡萄糖、氯仿、正丁醇、乙醇、丙酮、苯酚、浓硫酸均为分析纯;木瓜蛋白酶、牛血清蛋白、马斯亮蓝G-250均为生化试剂。

AG-135型电子天平;Heidolph WB-digit旋转蒸发仪;SHB-B95真空泵;101B-2型电热鼓风干燥箱;Varian-50CONC型紫外分光光度仪。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖提取 用水提取金银花药材，液料比12 mL/g，每次提取时间116 min，提取3次，提取温度96～100℃，得到水提物，减压浓缩至相对密度为1.08～1.12，用4倍体积量的无水乙醇沉淀，静置，抽滤，滤饼复溶于水，采用酶-Sevage法［4］对金银花粗多糖进行脱蛋白。水层再次醇沉，用乙醇、乙醚、丙酮洗淋，真空干燥，得粗多糖。

1.2.2 提纯［5-7］精密称取经预处理的树脂1.0 g置具塞锥形瓶中，加入2 mg/mL金银花粗多糖溶液100 mL，室温下置于恒温振荡器中，频率200 r/min振荡，使样品与树脂充分吸附，过滤，取滤液测定。计算多糖保留率、多糖的脱色率及蛋白脱除率。

1.3 分析方法

1.3.1 多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定［8］。

1.3.2 脱色率的测定［5］将金银花多糖水溶液配制成一定浓度，进行紫外-可见全波段(200～700 nm)扫描。结果显示，金银花多糖水溶液显浅黄棕色，扫描范围无明显的吸收峰，无最大吸收波长，根据互补色原理，金银花多糖水溶液吸收蓝灰色波段的可见光，选择波段中心360 nm为检测波长，测定溶液的吸光度，计算多糖脱色率。

其中，A前，A后分别为脱色前后的样品在360 nm处的吸光度值。

1.3.3 蛋白质脱除率测定［4］脱除率的计算公式如下:

其中，C前，C后分别为脱蛋白前后蛋白质的浓度。

2 结果与讨论

2.1 树脂筛选

7种大孔树脂法纯化金银花多糖的效果见表1。

表1 7种大孔吸附树脂纯化效果Table 1 Purification effect of seven kinds of macroporous adsorption resin

由表1可知，LS-206型大孔吸附树脂脱色率较高，达到82.13%，多糖保留率最高，蛋白脱除率可达到74.89%。因此，选择LS-206型树脂继续进行动态吸附研究。

2.2 动态单因素考察

2.2.1 上样量考察 取浓度为2 mg/mL金银花粗多糖溶液，上样流速为1 BV/h，考察1～5 BV(BV为树脂体积数)上样量对金银花纯化效果的影响，结果见图1。

图1 上样量对脱色率、多糖保留率及蛋白脱除率的影响Fig.1 Effect of sample quantity on absorption of colorants，polysaccharide retention rate and protein removal rate by LS-206 resin

由图1可知，上样量为2 BV时，多糖的脱色率在85%以上，当上样量达到3 BV以上时脱色率及脱蛋白率明显下降。

2.2.2 上样浓度考察 取2 BV多糖溶液上柱，流速为1 BV/h，考察上样浓度对金银花多糖纯化效果的影响，结果见图2。

图2 上样液浓度对脱色率、多糖保留率及蛋白脱除率的影响Fig.2 Effect of sample solution concentration on absorption of colorants，polysaccharide retention rate and protein removal rate by LS-206 resin

由图2可知，当溶液浓度在4 mg/mL时，纯化效果较好，但随着样品浓度提高，脱色效果快速下降。

2.2.3 上柱流速考察 取配制浓度为4 mg/mL，样品量为2 BV金银花粗多糖溶液上样，考察不同流速对金银花多糖纯化效果的影响，结果见图3。

由图3可知，流速在2 BV/h时，分离效果较好，随着流速增快，分离效果也呈现急速下降的趋势。

图3 上柱流速对脱色率、多糖保留率及蛋白脱除率的影响Fig.3 Effect of solution flow rate on absorption of colorants，polysaccharide retention rate and protein removal rate by LS-206 resin

2.3 响应面法考察动态吸附法纯化金银花多糖

2.3.1 实验结果 综合评价单因素实验的结果，以脱色率为指标，依据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，选取对色谱柱分离影响显著的上样浓度、上柱流速、上样量3个因素，设计3因素3水平面优化实验，通过 Design-Expert7.1.6响应面分析软件设计本实验，共有17组实验，其中12个是析因实验，5个中心实验。分析因素与水平设计见表2，响应面分析方案、实验结果见表3。

表2 响应面实验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

对各因素回归拟合后，得到回归方程为:Y=90.89 －1.06 X1－0.74 X2－0.26 X3－1.28 X1X2－0.55 X1X3+0.38 X2X3－ 1.45－ 1.36－

当P＜0.000 1时，所对应条件对响应值的作用是极其显著的;P＜0.05时所对应条件影响为显著。经分析，回归方程模型(P＜0.000 1)是高度显著的。用方程描述各单因素与响应值之间的关系时，因变量和全体自变量之间的线性关系显著(r=76.16/77.65=0.98)，表明该回归模型可靠且显著，用本模型来估算各因素对金银花多糖的大孔吸附树脂脱色过程的影响是合理的。3个因素中上样量和上柱流速为显著因素，3个因素对纯化过程影响大小顺序依次为上样量＞上柱流速＞上样浓度。上样量平方项、上柱流速平方项、上柱流速与上样量交互、上样量与上样浓度交互的影响也很显著。

通过响应面分析计算得，在稳定状态下，金银花多糖脱色的最佳工艺条件:上样量A=1.35 BV，上柱流速 B=1.44 BV/h，上样浓度 C=2.95 mg/mL，最大响应值(即脱色率)为91.10%。

表3 响应面优化方案设计及响应值Table 3 Response surface central composite design and response

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis table

续表4

图4 上样量与上柱流速对脱色率的交互影响Fig.4 Interaction of sample volume and elution flow rate on decolorization rate

图5 上样量与样品浓度对脱色率的交互影响Fig.5 Interaction of sample volume and sample solution concentration on decolorization rate

图6 样品浓度与上样流速对脱色率的交互影响Fig.6 Interaction of elution flow rate and sample solution concentration on decolorization rate

2.3.2 验证实验 为操作方便，修正优化工艺条件为:上样量 1.4 BV，上样流速 1.5 BV/h，上样浓度3 mg/mL，用蒸馏水冲洗，合并收集脱色溶液，浓缩，测其脱色率，结果见表5。

表5 验证实验结果Table 5 Verification test results

由表5可知，3次平行实验结果，多糖脱色率在90%以上，平均脱色率达91.04%，经检测多糖保留率为81.29%，脱蛋白率为83.83%。

3 结论

大孔树脂法工艺简单，成本低廉，可重复再生利用，纯化工艺过程温和，是有效且适宜的金银花多糖纯化方法。本研究采用静态吸附实验筛选出最适合的大孔树脂为LS-206型大孔吸附树脂，金银花多糖脱色最优工艺参数为:上样量1.4 BV，上样流速1.5 BV/h，样品浓度3 mg/mL。在此工艺条件下，金银花多糖脱色率为 91.04%，多糖保留率为81.29%，脱蛋白率为83.83%。为金银花进一步的分离纯化奠定了基础。

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