微波辅助提取牡丹雄蕊总生物碱工艺研究

马传利，郑国生，周远明，史美丽

(1.青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109;2.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109)

牡丹(Paeonia suffruticosa)属于观赏性植物，多年生落叶小灌木，是我国特有的花卉品种，长期以来中国人民把牡丹花当作吉祥富贵、繁荣昌盛的象征。牡丹花不但具有很高的观赏性和药用价值，而且还具有很高的食用价值。我国宋代就开始食用牡丹花。明代李时珍的《本草纲目》记载牡丹花是具有清热解毒功效的传统中药材，味较苦、药性平和，具有和血、生血、凉血的功效，主要治疗血中伏火、安神定气，消除烦热。近现代药理学研究可以发现，牡丹花中含有紫云英苷、缔纹天竺苷、丹皮花苷和多种人体所必需的氨基酸、微量元素和多种维生素［1-3］。因此，开展对牡丹花的有效成分的研究，具有十分重要的应用价值。

生物碱(alkaloid)是存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物，大多数有复杂的环状结构，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。本次研究通过对微波提取牡丹雄蕊生物碱的工艺研究，以苦参碱为对照品测定牡丹雄蕊中生物碱的含量［4-6］，希望能确定出牡丹花雄蕊中总生物碱的最佳提取工艺。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

牡丹雄蕊，采自青岛农业大学牡丹园，经青岛农业大学生命科学学院植物生理教研室鉴定为“凤丹”品种;苦参碱(生化试剂，含量≥91.7%)，中国药品生物制品检定所;溴甲酚绿;无水乙醇、氨水、甲醇、四氯化碳、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯仿、盐酸等均为分析纯。

XH-100A电脑微波催化/合成萃取仪;UV1601型紫外-可见分光光度计;AR2140电子分析天平。

1.2 溶液配制

1.2.1 对照品储备液的制备 精密称取于105℃干燥至恒重的苦参碱对照品0.017 0 g，置于小烧杯中，加入适量氯仿溶解后，转移至100 mL容量瓶中，加氯仿定容，摇匀，即得(每 1 mL含苦参碱0.17 mg)。

1.2.2 缓冲溶液的制备 准确称取 3.440 3 g KH2PO4，放入250 mL容量瓶A中，用蒸馏水定容至刻度。准确称取1.000 3 g NaOH，放入250 mL容量瓶B中，用蒸馏水定容至刻度。将A和B充分混合后，用盐酸定pH值至7.5，密封保存。

1.2.3 酸性染料液的制备 精密称取溴甲酚绿0.050 4 g于100 mL容量瓶中，加入上述缓冲溶液溶解，用水稀释摇匀，定容，制得0.05%溴甲酚绿缓冲液，备用。

1.3 实验方法

准确称取牡丹雄蕊粉末2.5 g，微波功率为700 W，乙醇浓度70%，料液比(质量体积比，g/mL)1 ∶20，浸润24 h，再微波加热提取6 min，过滤，测定吸光度值。

1.4 分析方法

1.4.1 检测波长的确定 精密吸取对照品溶液1.0 mL置于20 mL具塞锥形瓶中，加入氯仿10 mL。另取10 mL氯仿，置另一20 mL具塞锥形瓶中，制备空白液。各加蒸馏水5.0 mL，0.05%溴甲酚绿缓冲液2.0 mL，密塞，剧烈振摇3 min后移入60 mL分液漏斗中，静置20～30 min。分别取氯仿层置石英比色皿中，在300～500 nm波长范围内扫描，结果见图1。

图1 苦参碱标准品紫外扫描图Fig.1 The UV scan spectra of matrine standard

由图1可知，溶液在410.5 nm波长处有最大吸收。故选择410.5 nm作为检测波长。

1.4.2 标准工作曲线线性建立 准确量取苦参碱标准溶液 0.80，0.90，1.00，1.10，1.20，1.30 mL，分别放入6只120 mL分液漏斗中，分别加入氯仿10.00 mL，混匀，静置。再分别加入pH为7.5的缓冲溶液10.0 mL，溴甲酚绿溶液4.0 mL，振摇后静置1 h。分别取氯仿层，氯仿试剂为空白参比，在波长410.5 nm处测定吸光度A。用最小二乘法作线性回归，得到吸光度A与苦参碱浓度c(mg/mL)的线性关系曲线(见图2)，该曲线的回归方程为 A=34.605c－0.434 9，相关系数 R2=0.999 3。

图2 苦参碱标准溶液的浓度与吸光度的曲线图Fig.2 The curve of concentration to absorbance of standard solution of matrine

1.4.3 总生物碱含量的测定 准确称取2.5 g牡丹花雄蕊粉末提取液过滤，滤液转入250 mL容量瓶中，用80%乙醇定容至250 mL。取0.80 mL待测液于120 mL分液漏斗中，测定吸光度A。根据回归方程计算出待测液中牡丹雄蕊总生物碱的浓度c(mg/mL)。

2 结果与讨论

2.1 料液比对提取总生物碱含量的影响

实验条件同1.3节，考察料液比对提取总生物碱的影响，结果见图3。

图3 料液比对提取总生物碱的影响Fig.3 The effect of the ratio of sample weight to solvent volume on extraction of total alkaloids

由图3可知，增加提取溶剂的比例，总生物碱的提取率逐渐增高，料液比1∶20(g/mL)时达最高，故料液比为1∶20(g/mL)较为合适。

2.2 微波加热时间对提取总生物碱含量的影响

实验条件同1.3节，考察微波加热时间对总生物碱提取率的影响，结果见图4。

图4 微波加热时间对提取总生物碱的影响Fig.4 The effect of microwave radiation time on extraction of total alkaloids

由图4可知，微波加热提取时间10 min时提取率最高，超过10 min，提取率反而降低。故选择提取时间为10 min。

2.3 微波提取功率对提取总生物碱含量的影响

其他条件同1.3节，微波加热提取时间为10 min，考察微波功率对提取率的影响，结果见图5。

图5 微波功率对提取总生物碱的影响Fig.5 The effect of microwave power on extraction of total alkaloids

由图5可知，微波提取功率在500 W时牡丹雄蕊总生物碱提取率最高，功率过高提取率反而严重降低。故选择微波功率500 W为宜。

2.4 乙醇浓度对提取总生物碱含量的影响

其他条件同1.3节，提取功率为500 W，考察乙醇浓度对提取率的影响，结果见图6。

由图6可知，增加乙醇的浓度可以提高总生物碱的提取率，但浓度超过70%以后，提取率有所下降。综合考虑，乙醇浓度70%时最佳。

图6 乙醇浓度对提取总生物碱的影响Fig.6 The effect of ethanol concentration on extraction of total alkaloids

2.5 浸润时间对提取总生物碱含量的影响

分别准确称取牡丹雄蕊粉末2.5 g 5份，以料液比为1∶20，提取功率为500 W，乙醇浓度70%，选择不同的浸润时间 6，12，24，48，100 h 进行实验，微波加热提取时间为10 min，结果见图7。

图7 浸润时间对提取总生物碱的影响Fig.7 The effect of soakage time on extraction of total alkaloids

由图7可知，延长浸润时间可以提高生物碱的提取率，但时间超过24 h以后，提取率反而会下降。综合考虑，以浸润时间24 h为最佳。

2.6 溶液pH值对提取总生物碱含量的影响

分别准确称取牡丹雄蕊粉末2.5 g 5份，微波加热提取时间为10 min，料液比为1∶20，提取功率为500 W，乙醇浓度70%，浸润时间为24 h，选择不同的 pH 值 3.0，5.0，7.0，9.0 进行实验，结果见图 8。

图8 pH值对提取总生物碱的影响Fig.8 The effect of pH value on extraction of total alkaloids

由图8可知，增大pH值可以提高提取率，但pH值超过7.0以后，提取率下降，综合考虑，pH值为7.0时最佳。

2.7 正交实验

为了全面考察各因素对牡丹花雄蕊的提取效果，我们设计了6因素3水平的正交实验，考察料液比、浸润时间、微波加热提取时间、微波功率、pH值和乙醇浓度对牡丹雄蕊中生物碱提取率的影响，因素水平安排和实验结果见表1。

表1 正交实验结果Table 1 Results of orthogonal experiments

由表1可知，6个因素对实验结果影响大小依次是:料液比(A)＞浸润时间(B)＞乙醇浓度(F)＞pH值(E)＞微波加热提取时间(C)＞微波功率(D)，尤其是料液比(A)、浸润时间(B)和乙醇浓度(F)这3个因素影响显著。空白列的极差最小，表明没有其它影响较为明显的因素存在，本实验考察的影响因素较为完全。

由表1可知，微波提取牡丹雄蕊总生物碱的最佳工艺条件为A3B2C3D2E1F3，即料液比1∶20，浸润时间24 h，微波加热提取时间 15 min，微波功率500 W，pH值3和乙醇浓度80%。

按照最佳工艺实验条件进行实验，得到总生物碱提取液的吸光度A值为0.164 5，优于正交实验中的任何一组实验，换算成提取率为2.16%。因此，可以确定最优方案。

3 结论

用微波法提取牡丹雄蕊中总生物碱的最佳提取工艺条件为:料液比1∶20，浸润时间24 h，微波加热提取时间15 min，微波功率500 W，pH值3和乙醇浓度80%，该工艺条件下，牡丹雄蕊中总生物碱提取率为2.16%。

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