小儿柴桂退热糖浆药效学研究

王勇,刘晓锋

(1.湖北省松滋市人民医院药剂科,松滋 434200;2.湖北省食品药品监督检验研究院,武汉 430064)

小儿柴桂退热糖浆药效学研究

王勇1,刘晓锋2

(1.湖北省松滋市人民医院药剂科,松滋 434200;2.湖北省食品药品监督检验研究院,武汉 430064)

目的 观察小儿柴桂退热糖浆的解热、抗炎、抗病毒作用。方法通过大鼠干酵母致发热模型观察小儿柴桂退热糖浆解热作用,通过小鼠巴豆油致耳廓肿胀模型观察小儿柴桂退热糖浆抗炎作用,通过细胞培养法观察小儿柴桂退热糖浆体外抗病毒作用。结果小儿柴桂退热糖浆能降低酵母所致发热大鼠第4至第6小时时间点体温升高值,降低巴豆油致小鼠耳廓的肿胀度,对感染甲型流感病毒的狗肾传代细胞(MDCK细胞)具有保护作用。结论小儿柴桂退热糖浆具有解热、抗炎、抗病毒作用。

小儿柴桂退热糖浆;解热作用;抗炎作用;抗病毒作用

小儿柴桂退热糖浆主要由柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黄芩、白芍、蝉蜕等中药组成,是根据小儿柴桂退热颗粒改变剂型的新药,具有发汗解表、退热的功效。小儿柴桂退热颗粒主要用于小儿外感发热、头身痛、流涕、口渴、咽红、溲黄、便干等症状,对其解热、抗炎、抗病毒作用鲜有报道。笔者在本实验中通过动物实验,对小儿柴桂退热糖浆的解热、抗炎、抗病毒作用进行验证。

1 材料与方法

1.1 动物 斯泼果格·多雷(Sprague Danley,SD)大鼠,SPF级,雌雄各半,体质量170～190 g,由武汉大学动物实验中心提供,生产合格证号:SCXK(鄂)2008-0004,湖北省食品药品监督检验研究院动物实验设施使用合格证号:SYXK(鄂)2008-0009。昆明小鼠,SPF级,雌雄各半,体质量18～19 g,由武汉生物制品研究所有限责任公司提供,生产合格证号:SCXK(鄂) 2008-0003。湖北省食品药品监督检验研究院动物实验设施使用合格证号:SYXK(鄂)2008-0003,湖北省食品药品监督检验研究院动物实验设施使用合格证号:SYXK(鄂)2008-0009。

1.2 试药及其制备 受试物小儿柴桂退热糖浆,湖北襄阳隆中药业集团有限公司提供,批号:20110101,规格:每支10 mL。人拟临床最大用量为80 mL·d-1,儿童(7～14岁)体质量按30kg计,用量为2.65 mL·kg-1,相当于生药量1.33 g·kg-1(1 mL糖浆含生药0.5 g)。临用前纯化水配制成高、中、低剂量的稀释液。阳性对照药物阿司匹林由沈阳奥吉娜药业有限公司提供,规格:每片100 mg,批号:120404,临用前研钵研细,用纯化水配制成7.4 mg·mL-1混悬液;吲哚美辛片,商品名:消炎痛,临汾奇林药业有限公司生产,规格:每片25 mg,批号:1102071,临用前纯化水配制成0.283 mg·mL-1;利巴韦林注射液,湖北天药药业股份有限公司,规格:1 mL∶0.1 mg。造模药物干酵母片,安徽宏业药业有限公司提供,规格:每片0.2 g,批号:110705;20%干酵母混悬液的制备:取干酵母10 g,逐渐加入纯化水磨为均匀的悬浆,定容至50 mL即得;巴豆油为本实验室从巴豆药材提取的挥发油部分。最低必需培养液(Eagle's minimumessential medium, EMEM)细胞培养基,GIBCO,批号:6721953;四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl tetrazolium,MTT);Duchefa,批号:BS0880;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司,批号:101207。狗肾传代细胞(Madin-Darby Canine Kidney,MDCK细胞,传第3代后使用),甲型流感病毒,均由湖北省疾病预防控制中心提供。

1.3 仪器 XB-8656型电子体温计,无锡新中瑞婴儿用品有限公司;ML303型电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司制造;动物秤MJ5102电子秤,余姚纪铭称重校验设备有限公司;DS-671型电子秤,上海寺冈电子有限公司制造。

1.4 对酵母所致发热大鼠体温的影响 取SD大鼠70只,电子体温计肛门测量体温(温度计插入肛门2 cm),每天测体温2次(间隔1 h),连续3 d,选取每天体温变化不超过0.5℃的大鼠60只,按体质量随机均分为6组,分别为正常对照组(不造模,给纯化水),模型对照组(造模,给纯化水),阳性对照组,受试物高、中、低剂量组,因体温可前后对照,故不设空白对照组[1]。各组每天灌胃给药2次,连续3 d,正常对照组纯化水(13.3 mL·kg-1),模型对照组纯化水(13.3 mL·kg-1),阳性对照组(阿司匹林, 200 mg·kg-1,13.3 mL·kg-1),受试物高、中、低剂量组(剂量分别为26.5,13.3,6.6 mL·kg-1,相当于生药量13.3,6.6,3.3 g·kg-1,相当小儿拟临床用量的10,5,2. 5倍剂量)。于给药第3天致热。致热前测体温2次,取平均值作为大鼠基础体温。各组大鼠背部皮下注射20%干酵母混悬液7.5 mL·kg-1,致热后按前述剂量各组给药。测量给药后1～6 h大鼠体温,每小时1次。计算不同时间点大鼠体温升高值(不同时间点大鼠体温与基础值的差值)[2]。

比较模型对照组与正常对照组大鼠体温升高情况,判断大鼠发热模型是否成功。同时在各时间点,分析模型对照组的体温升高值与阳性对照组和受试物高、中、低剂量组的差异显著性,统计采用ONE-WAY ANOVA法,方差齐性采用LSD多重分析,方差不齐采用Dunnett's T3多重分析[3]。

1.5 对巴豆油致小鼠耳廓肿胀的影响 取小鼠50只,随机分为5组,分别为阴性对照组、阳性对照组和受试物高、中、低剂量组,每组10只。各组每天灌胃给药2次,连续7 d,阳性对照组仅最后2 d给药。阴性对照组给予纯化水(26.5 mL·kg-1),阳性对照组(吲哚美辛, 7.5 mg·kg-1,26.5 mL·kg-1),受试物高、中、低剂量组(剂量分别为53.0,26.5,13.3 mL·kg-1,相当于生药量26.5,13.3,6.6 g·kg-1,相当人拟临床用量的20,10,5倍剂量)。末次给药后1 h,将2%巴豆油(巴豆油2%,无水乙醇20%,乙醚78%)0.05 mL涂在小鼠右耳前后两面致炎,致炎后4 h将小鼠处死,用直径9 mm打孔器在小鼠左右耳相同部位打下耳片,用电子天平称质量。记录左右耳片质量,计算肿胀度。

肿胀度(mg)=右耳片质量-左耳片质量,耳廓肿胀抑制率(%)=(阴性对照组耳廓肿胀度均值-给药组耳廓肿胀度均值)/阴性对照组耳廓肿胀度均值× 100%。

分别分析阴性对照组的肿胀度与阳性对照组、受试物高、中、低剂量组的差异显著性,统计方法采用ONE-WAY ANOVA,方差齐性采用LSD多重分析,方差不齐采用Dunnett's T3多重分析[4]。

1.6 体外抗甲型流感病毒作用(无菌条件下)

1.6.1 细胞的培养 取受试物溶液,用EMEM培养液按2,4,6,8,10,20,40倍稀释作为受试浓度,用孔径0.22 μm滤膜无菌过滤处理。将对数生长期的MDCK细胞稀释成含细胞1×106个·mL-1浓度,按每孔0.1 mL接种于96个孔板。培养24 h,贴壁完整后除去培养液,加入上述各稀释度的受试物0.1 mL,每浓度重复6孔,另设空白及阴性对照组。继续培养72 h,观察细胞形态和生长状态(与对照组比较),选择最大无细胞毒剂量(稀释度),作为最大受试剂量(浓度)[5]。

1.6.2 病毒原液对MDCK细胞的半数致细胞病变剂量(tissue culture infective dose,TCID50) 将病毒原液用D-Hank's液(Sigma公司提供)按10-1,10-2,10-3, 10-4,10-5,10-6梯度稀释,将对数生长期的MDCK细胞稀释成含细胞1×106个·mL-1,按每孔0.1 mL接种于96个孔板。培养24 h,贴壁完整后除去培养液,加入上述各稀释度的病毒液0.1 mL,每组重复8孔,继续培养24 h,观察各孔细胞病变程度。采用SPSS15.0版统计软件计算半数致细胞病变剂量TCID50[6]。

1.6.3 受试物对甲型流感病毒致MDCK细胞病变的保护作用 将6,8,10,20,40倍稀释梯度的受试溶液分别与100倍50%组织细胞感染量(100 TCID50)病毒液等量混合,阳性对照物为0.5 mg·mL-1的利巴韦林EMEM培养液稀释液,阴性对照为EMEM培养液,分别与100 TCID50病毒液等量混合(0.5 mL+ 0.5 mL),37℃中和30 min。将对数生长期的MDCK细胞稀释成1×106个·mL-1,按每孔0.1 mL接种于96个孔板,培养24 h,贴壁完整后除去培养液,分别取0. 1 mL加入上述中和液,每组重复6孔,另设细胞空白组,共8组。37℃,CO2培养箱培养72 h,MTT法检测各孔吸光度值(ELX800型酶标仪,Biotek)[7]。

受试物各剂量组、阳性对照组、空白组吸光度分别与阴性对照组吸光度比较,采用SPSS15.0版统计软件,统计采用ONE-WAY ANOVA法,方差齐性采用LSD多重分析,方差不齐采用Tamhane多重分析[8]。

2 结果

2.1 对酵母所致发热大鼠体温的影响 不同时间点大鼠体温升高值见表1,模型对照组较正常对照组大鼠第2～第6小时体温升高(P＜0.05或P＜0.01),表明造模成功。与模型对照组比较,阳性对照组第2～第6小时体温升高值降低,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05),受试物中剂量组第4～第6小时体温升高值降低,差异有统计学意义(P＜0.05),说明小儿柴桂退热糖浆能降低酵母所致发热大鼠的体温,具有解热作用[9]。

2.2 对巴豆油致小鼠耳廓肿胀的影响 各组药物对巴豆油致小鼠耳廓肿胀的影响结果见表2。阳性对照组,受试物高、中、低剂量组耳廓肿胀度低于阴性对照组,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05),表明小儿柴桂退热糖浆能抑制巴豆油致小鼠耳肿胀作用,说明小儿柴桂退热糖浆具有抗炎作用[10]。

2.3 体外抗甲型流感病毒作用 受试物2,4倍稀释液无法通过孔径0.22 μm滤膜,故选择6,8,10,20,40倍稀释液实验,各稀释液对细胞的生长均无影响,最大无细胞毒剂量(稀释度)为6倍,受试药体外抗甲型流感病毒作用浓度选择为6,8,10,20,40倍稀释液。经实验,病毒TCID50=10-4.7,100 TCID50=1/500,故选择1/500倍病毒稀释液进行。阳性对照组、受试物6, 8,10倍稀释剂量组吸光度值明显高于阴性对照组,差异有统计学意义,说明细胞存活度明显高于阴性对照组,20,40倍稀释剂量组差异无统计学意义,空白组与阴性组比较,差异有统计学意义,对感染甲型流感病毒的MDCK细胞具有保护作用。结果见表3,提示小儿柴桂退热糖浆体外有抗甲型流感病毒作用[11]。

表1 6组大鼠不同时间体温测定结果 n=10

表2 5组小鼠耳廓肿胀度与肿胀抑制率测定结果 n=10

实验表明,受试物稀释剂6,8,10倍量具有体外抗甲型流感病毒作用。

表3 8组吸光度值测定结果 ±s

表3 8组吸光度值测定结果 ±s

与阴性对照组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01

组别细胞孔数吸光度值空白组60.901±0.079*1阴性对照组60.110±0.024阳性对照组60.741±0.101*1受试物6倍稀释组60.578±0.084*1受试物8倍稀释组60.569±0.085*1受试物10倍稀释组60.341±0.059*2受试物20倍稀释组60.119±0.035受试物40倍稀释组60.104±0.007

3 讨论

酵母菌属真菌类,其致热成分是全菌体及菌体内所含的荚膜多糖和蛋白质。研究表明,其所致的发热是由注射部位的局部溃烂引发的剧烈炎症反应导致,动物注射后发热反应与人类临床发热类似,适合考察清热药的解热作用。巴豆油局部耳刺激作用可使小鼠耳毛细血管通透性增高,血管内液向组织间隙渗出导致耳廓肿胀,适合考察药物抗炎作用。MDCK细胞对甲型流感病毒敏感,细胞被感染后产生细胞死亡,一般用于研究药物体外抗流感病毒实验[12]。

笔者在本实验中采用对酵母所致发热大鼠体温的影响,对巴豆油致小鼠耳廓肿胀的影响,MDCK细胞体外抗甲型流感病毒实验验证受试物的清热、抗炎、抗病毒作用。

实验结果表明小儿柴桂退热糖浆可降低酵母所致发热大鼠的体温,明显减轻巴豆油致小鼠耳廓肿胀度,提高体外甲型流感病毒致细胞病变的存活率,具有一定的解热、抗炎及体外抗甲型流感病毒作用。

[1] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,2006:814-815,818-820,830-831.

[2] 彭成.中医药动物实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2008:975-982.

[3] 唐晓峰,薛漫清,王晖.大鼠发热模型及发热机制的研究进展[J].广东药学院学报,2009,25(3):327-331.

[4] 杨鸿,李慧,张文生,等.复方栀子注射液解热抗炎作用的研究[J].中国中医药信息杂志,2005,12(5):25-27.

[5] 初正云,翟延君,张慧.解毒胶囊的解热、抗炎、止痛和止咳作用[J].中成药,2008,30(2):181-184.

[6] 潘文,康开彪,王煜.清利通淋汤解热抗炎作用实验[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(15):192-194.

[7] 陈海明,魏金峰,包捷,等.复方解热颗粒制剂的药效及急性毒性研究[J].临床和实验医学杂志,2007,6(1): 11-12.

[8] 曲敬来,林娟,高雪,等.痰热清注射液抗甲型流感病毒的实验研究[J].中国中医药科技,2012,19(1):28-29.

[9] 朱成杰,赵昆,王桂芳,等.天然多糖在体外抗甲型流感病毒作用的普遍性[J].中国抗生素杂志,2010,35(12): 919-923.

[10] 王黎,夏卫军.童炎康颗粒体外抗病毒作用的研究[J].中医临床研究,2009,(1):12-14.

[11] 赵宏伟,赵玉珍.金莲花醇提物体外抗甲型流感病毒作用研究[J].药物研究,2010,19(1):10-11.

[12] 赵宏伟,赵玉珍.黄芪和秦艽提取物抗甲型流感病毒研究[J].郧阳医学院学报,2010,29(2):138-140.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.010

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0878-03

2013-08-12

2013-09-15

王勇(1974-),女,湖北松滋人,主管药师,学士,主要从事医院药学研究。E-mail:wangy74@163.com。

刘晓锋(1978-),男,湖北荆州人,工程师,硕士,研究方向:药理学。E-mail:506219744@qq.com。