柴胡疏肝散分煎混合液和合煎液指纹图谱及有效成分变化分析*

李吉锋，王淑荣

(渭南师范学院化学与生命科学学院药物分析工程中心，渭南 714099)

柴胡疏肝散分煎混合液和合煎液指纹图谱及有效成分变化分析*

李吉锋，王淑荣

(渭南师范学院化学与生命科学学院药物分析工程中心，渭南 714099)

目的 分析复方柴胡疏肝散分煎液和合煎液中芍药苷和橙皮苷的溶出量和色谱指纹图谱相似度,确认是否适合采用临床颗粒复配方法使用。方法采用高效液相色谱法进行含量测定,用中药色谱指纹图谱相似度软件对谱图相似度进行分析。结果合煎有利于有效成分芍药苷和橙皮苷的溶出,合煎过程发生化学反应,有少量新的组分生成或者部分组分消失。结论复方柴胡疏肝散不适合采用颗粒配方服用。

柴胡疏肝散分煎液；柴胡疏肝散合煎液；溶出量；指纹图谱

柴胡疏肝散出自《景岳全书》第五十六卷,由陈皮(醋炒)、柴胡各6 g,川芎、枳壳(麸炒)、白芍、香附各4.5 g,甘草(炙)1.5 g组成,可疏肝解郁,主治肝气郁滞证。传统中药煎剂使用方法历经数千年,各种有效、有害成分的协同或拮抗效应已经过实际检验,能够充分发挥其药效,减少毒性。目前一些医院为方便患者使用,让患者将单味颗粒组成复方以后冲服。由于各单味中药是提前分煎得到,组成复方过程的协同或者拮抗作用的可能性降低,有可能对于某一方剂的药效产生影响。对于中药复方前后单味中药药性的变化,科研工作者近年来逐渐从化学角度开始探讨。很多分析工作者对于使用比较多的复方进行了分析[1-9]。笔者在本实验中采用高效液相色谱法对于柴胡疏肝散分煎液和合煎液中的有效成分芍药苷和橙皮苷的溶出量进行分析比较,讨论两种不同煎煮方法对有效成分溶出的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ShimadzuLC-10ATVP泵,SCL-10AVP控制器,DGU-14A脱气机,CTO-10AVP柱温箱,SPD-10AVP紫外检测器,ShimadzuC-18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),ShimadzuClass-VP6.12工作站,SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣),超声脱气机(KQ-250DE数控超声,昆山超声仪器厂)。

1.2 试药 甲醇(色谱纯,天津科密欧),乙腈(色谱纯,天津科密欧),磷酸(AR,开封化学试剂厂),二次纯化水,芍药苷对照品(宝鸡晨光生物科技有限公司,批号:20121005,纯度:98%),橙皮苷对照品(宝鸡晨光生物科技有限公司,批号:20120927,纯度:98%);柴胡(陕西)、白芍(浙江)、陈皮(江西)、枳壳(江西)、香附(山东)、川芎(四川)、甘草(宁夏)均购自陕西省渭南市老百姓大药房,所有饮片均经驻店药师确认。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 0.2%磷酸-乙腈梯度洗脱,洗脱程序见表1,流速1.0 mL·min-1,柱温30℃,检测波长230 nm。中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版(国家药典委员会)。

2.2 对照品溶液的制备 配制对照品溶液,称取芍药苷和橙皮苷对照品精密称定,加甲醇超声溶解后定容于50 mL量瓶,分别配成50.00 mg·L-1对照品溶液。两种对照品溶液各进样10 μL的谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 芍药苷和橙皮苷对照品HPLC色谱图S1.芍药苷;S2.橙皮苷

2.3 样品溶液的制备

2.3.1 合煎液的制备 按照复方用量准确称取各味中药于500 mL烧杯,加入8.5倍质量二次纯化水,盖上表面皿,浸泡10 min,于电炉上大火烧开,小火煎煮20 min,冷却后倾出上清液。再加入4.5[9]倍质量的二次纯化水,大火烧开后小火煎煮15 min,倾出上清液,并与第一次的清液合并,定容到100 mL量瓶。准确量取25.00 mL,水浴低温蒸干得到颗粒,加入甲醇超声处理后定容于25 mL量瓶,进样前用孔径0.45 μm滤膜过滤[9]。进样10 μL,合煎液色谱图见图2。

2.3.2 分煎混合液的制备 按照复方用量分别准确称取各味中药于7个100 mL烧杯,分别加入8.5倍质量二次纯化水,盖上表面皿,浸泡10 min,于电炉上大火煮沸,小火煎煮20 min,冷却后分别倾出上清液,混合于同一烧杯中。分别在7种中药中各加入4.5倍质量二次纯化水,大火煮沸后小火煎煮15 min,冷却后分别倾出上清液,混合后与第一次的合并,定容到100 mL量瓶。准确量取25.00 mL,水浴低温蒸干得到颗粒,加入甲醇超声处理后定容于25 mL量瓶。进样前用孔径0.45 μm滤膜过滤。进样10 μL,分煎液谱图见图2。对合煎液和分煎液指纹图谱采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版进行相似度分析比较。

2.4 色谱测定方法考察

2.4.1 精密度实验 将2种对照品溶液各连续进样5次,测定色谱峰面积。芍药苷和橙皮苷面积的RSD分别为1.6%和1.3%,表明方法精密度较好。

图2 柴胡疏肝散合煎液和分煎液HPLC图S1.分煎液;S2.合煎液

2.4.2 线性范围考察 分别取各对照品溶液分别进样5,10,15,20,25 μL,分别测定峰面积。以测得的各对照品溶液的峰面积为纵坐标,以进样量为横坐标,得到标准回归方程和相关性系数。各对照品在0.25～1.25 μg范围内线性关系良好。芍药苷回归方程Y= 58 704X+519 939,r=0.993 2;橙皮苷回归方程Y=174 674X+457 984,r=0.997 3。

2.4.3 回收率实验 准确量取混合后合煎液25.00 mL,加入一定量芍药苷和橙皮苷标准溶液,水浴低温蒸干,加入甲醇超声处理后定容于25 mL量瓶。进样前用孔径0.45 μm滤膜过滤,测定后计算各个对照品的回收率。

据“2.3.3”加标实验测定结果计算,加标回收率分别为芍药苷92.5%和橙皮苷95.4%(5次平均,RSD分别为1.2%和1.4%),方法准确性较好。见表2。

表2 芍药苷和橙皮苷回收率实验结果 mg

2.4.4 稳定性考察 取分煎液,分别在0,2,4,8,12 h进样,测定峰面积,结果芍药苷和橙皮苷的RSD分别为0.9%,1.3%。

2.4.5 重复性实验 按照“2.3.1”项制备合煎液溶液5份,分别测定芍药苷和橙皮苷的含量,RSD分别为1.2%和1.2%。

2.5 测定结果 将“2.3.1”和“2.3.2”项实验所得溶液分别用HPLC在“1.1”项仪器工作条件下测定。结果复方后合煎液芍药苷含量1.456 mg,橙皮苷含量0.578 mg,分煎后混合液芍药苷与橙皮苷含量分别为1.332和0.324 mg。

3 讨论

中药组成复方后可能存在协同或者拮抗效应,使得煎煮过程中各种有效成分的溶出率发生变化,也可能发生化学反应,使得某一组分的溶出量发生变化,从而对其功效产生影响。中成药加工过程充分考虑以上因素,采取方剂合煎后,将得到的粉末制成丸剂或者片剂服用,使得其组成和煎剂相同,功效相同。而目前一些医院采用将分煎后得到的颗粒按照复方混合冲服的方法没有充分考虑以上问题。针对可能存在的问题,笔者选择传统的柴胡疏肝散方剂,针对其中芍药苷和橙皮苷的溶出量进行分析。结果发现,对于柴胡疏肝散而言,合煎液中芍药苷溶出量(1.456 mg)稍高于分煎液(1.332 mg),合煎液橙皮苷溶出量明显高于分煎液,接近或达到分煎液溶出量的两倍。实验结果说明,对于柴胡疏肝散而言,合煎可能由于协同效应等,更有利于其有效成分芍药苷和橙皮苷的溶出,使得药效更明显。采用中药色谱指纹图谱相似度软件分析后发现,分煎液和合煎液的谱图相似度为0.953,这表明在合煎过程中发生了化学反应,有少量新的组分生成或者部分组分消失,如在约15 min和48 min合煎液相对分煎液分别减少一个吸收峰,具体组分确认及变化分析需要结合质谱测定结果进行分析。除芍药苷和橙皮苷外,从图2还可以发现,两个谱图中的其他一些峰高度也存在差异,说明合煎使得不同组分的溶出率发生了变化。综上所述,建议柴胡疏肝散临床使用不采用颗粒物配伍使用的方法,而尽可能采用生药合煎服用的方法。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.035

R286;R927.1

A

1004-0781(2014)03-0392-03

2013-05-01

2013-06-22

*陕西省军民融合研究基金(12JMR12)

李吉锋(1977-),男,山东青岛人,副教授,硕士,主要从事药物分析工作。电话:0913-2136931,E-mail：ustc1@163.com。