rhGM-CSF及纳米银对深Ⅱ度烫伤创面愈合过程血管化的影响*

杨景哲,温海玲,耿琪瑛,陈凤平,冯欣姝

(承德医学院附属医院烧伤整形科,承德 067000)

rhGM-CSF及纳米银对深Ⅱ度烫伤创面愈合过程血管化的影响*

杨景哲,温海玲,耿琪瑛,陈凤平,冯欣姝

(承德医学院附属医院烧伤整形科,承德 067000)

目的 研究外用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和纳米银敷料外用,对深Ⅱ度烫伤创面组织愈合及血管化的影响。方法用Wistar大鼠建立深Ⅱ度烫伤模型,分为A、B、C组。A组(n=30):凡士林纱布覆盖,B组(n=30):纳米银敷料覆盖,C组(n=30):rhGM-CSF涂抹创面。伤后第1,4,7,10,14,21天,观察创面病理学改变,按照酶联免疫吸附法测定血清中血管内皮生长因子(VEGF)水平,采用实时-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测创面愈合过程中缺血坏死因子-1α(HIF-1α)mRNA表达的变化。结果病理学改变:A、B、C组均在第10天出现明显的血管化;创面愈合率:C组＞B组＞A组,第14天、第21天时,组间差异有统计学意义(P＜0.05)。VEGF水平:伤后第1天3组间差异无统计学意义(P＞0.05),第4,7,10,14天3组间及第21天A组和C组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。HIF-1αmRNA相对表达量:A组第14天达峰值,B组、C组逐渐增大,第10天达峰值,随后下降,且C组下降幅度最明显,第1天A组与B组、C组之间差异有统计学意义(P＜0.05),第4天,3组间差异无统计学意义(P＞0.05),第7天A组与C组之间及第10,14,21天各组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论rhGM-CSF和纳米银外用,促进深Ⅱ度烫伤创面愈合过程中血管化的形成,并且rhGM-CSF血管化程度优于纳米银。

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;纳米银;烫伤创面;血管内皮生长因子;缺血坏死因子

烫伤创面外用敷料的研究,尤其是对于深Ⅱ度创面,是目前的烫伤研究的热点,重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rhGM-CSF)是基因工程产物,外用rhGM-CSF主要通过适度炎症反应、促进角化上皮细胞增殖以及促进局部新生血管形成等机制发挥促进创面愈合作用[1]。纳米银敷料主要通过抗感染作用加速创面愈合,其促进创面愈合的作用已经被充分证实[2]。本研究旨在通过建立深Ⅱ度烫伤大鼠模型,研究外用rhGM-CSF及纳米银对缺血坏死因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)mRNA和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,探讨二者在促进血管化方面的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 Wistar大鼠,SPF级,90只,体质量200～220 g,雌雄各半,由天津山川红实验动物科技有限公司购买,动物许可证号:SCXK(津)2009-0001。大鼠于实验室条件下的动物房内,温度(24±3)℃,常规配方饲料喂养和自来水饮水,按照国家卫生实验动物护理和使用指南进行。水合氯醛1 mL·kg-1腹腔注射麻醉,背部去毛后用99℃纱布覆盖10 s,造成约4 cm× 4 cm深Ⅱ度烫伤创面(病理切片证实),伤后创面分别用A、B、C 3种方法处理,每组30只。A组:凡士林纱布覆盖;B组:0.9%氯化钠溶液湿润纳米银医用抗菌敷料(深圳市爱杰特医药科技有限公司)覆盖,A组、B组敷料完全覆盖创面即可;C组:rhGM-CSF(长春金赛药业有限公司)涂抹创面,每次涂抹约2 g。A组、B组、C组大鼠创面每天换药,分别于伤后第1,4,7,10, 14,21天留取皮肤标本1 cm×1 cm,留取血标本一份约3 mL,至第21天,终止实验。

1.2 创面病理观察 创面换药时分别于伤后第1,4, 7,10,14,21天观察各组创面炎症反应情况,创面组织标本在苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色情况下观察细胞浸润、血管通透性、炎细胞趋化及血管化程度。

1.3 创面愈合率计算 创面摄相,计算创面愈合面积,计算创面愈合率。创面愈合率(%)=(创面总面积-残余创面面积)/创面总面积×100%。

1.4 VEGF检测 血清标本解冻,按照酶联免疫吸附法测定各标本血清中VEGF水平,试剂盒购买自武汉华美生物工程有限公司,按照说明书操作。

1.5 HIF-1αmRNA水平的检测 将组织标本加入Trizol,用Trizol总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,经紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度,重复测定3次,A260和A280之比值应在118～210,计算样品总RNA浓度。引物序列为:HIF-1αcDNA扩增的上游引物5′-AACAAACAGAATCTGTCCTCAAACC-3′,下游引物5′-CAGGTAATGGAGACATTGCCAG-3′,产物片段长度为296 bp;β-actic上游引物5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′,下游引物5′-ACTCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,扩增片段长度220 bp。取总RNA 1μg,加入Oligo(dT)18 Primer,70℃温育5 min;迅速放入冰浴中,加入10mmol·L-1dNTP,RNA酶抑制剂,5×缓冲液,42℃温育5 min;冰浴中加入5 U·μL-1AMV逆转录酶,加入DEPC处理水至总体积20μL, 42℃温育60 min,70℃10min,立置冰上,-80℃冰箱保存备用。将反应管置于PCR(美国MJ公司PTC-220)仪上,95℃预变性10 min后,进入95℃变性1 min,50℃退火15 min,72℃延伸10 min的循环,共34次,最后72℃充分延伸10 min。反应完成后取PCR反应液10μL,经1%琼脂糖凝胶电泳,用PCRMarker作分子量标准。电泳完毕后在紫外荧光数字成像仪下观察结果。以每只大鼠HIF-1α与β-actin扩增产物条带吸光度的比值作为HIF-1αmRNA的相对表达量。

1.6 统计学方法 运用SPSS16.0版统计软件进行统计学分析。F检验比较创面愈合率及VEGF、HIF-1α mRNA相对表达量在同时间点各组的差异,SNK-q检验比较同时间点组内两两比较的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面病理学表现 A、B、C 3组均在第10天出现明显的血管化,A组创面伤后红肿明显,切片可见大量炎性细胞浸润、聚集、迁移,血管壁通透性增加,血管化程度不高(图1A);B组创面伤后红肿,在伤后第4天炎症反应最重,切片可见炎性细胞浸润、聚集、迁移,血管壁通透性增加,血管化程度较A组加快,至第14天因为创面溶痂,炎症反应较前略有加重(图1B);C组创面伤后红肿,较A、B组明显减轻,切片可见适量炎性细胞浸润、聚集、迁移,血管壁通透性增加,血管化进程最快(图1C)。

2.2 创面愈合率 在伤后第1,4,7天各组创面均未出现愈合,第10,14,21天创面愈合率C组＞B组＞A组。第10天,3组之间差异无统计学意义(P＞0.05);第14,21天,3组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 血清VEGF水平 A组VEGF水平在烫伤后一直逐渐上升,B组、C组逐渐上升,第14天达到峰值,第21天水平下降,可能与B组、C组第21天创面溶痂完成,局部微循环改善有关,血管化程度降低,尤其是C组下降幅度最大。VEGF水平在第1天各组间差异无统计学意义(P＞0.05),第4,7,10,14天各组间差异有统计学意义(P＜0.05),第21天,A组、C组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.4 HIF-1αmRNA的相对表达量 HIF-1α与βactin扩增产物均显示为清晰的条带。HIF-1α与βactin条带吸光度的比值作为HIF-1αmRNA相对表达量,结果显示,HIF-1αmRNA相对表达量,A组持续增大,第14天达峰值,B组、C组逐渐增大,第10天达峰值,随后逐渐下降,可能与创面溶痂快慢、局部坏死组织脱落程度及缺血、缺氧程度有关,且C组下降幅度最明显。第1天A组与B组、C组之间差异有统计学意义(P＜0.05),第4天,3组间差异无统计学意义(P＞0.05),第7天A组与C组之间差异有统计学意义(P＜0.05),第10,14,21天3组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

3 讨论

A.A组;B.B组;C.C组图1 3组大鼠烫伤后第14天创面血管化情况(HE染色,×200)A.group A;B.group B;C.group CFig.1 Vascularization of wound surface in three groups of rats 14 days after burn(HE staining,×200)

表1 3组大鼠不同时间点愈合率比较Tab.1 Healing rate of three groups of rats at different time points %

正常的烫伤创面愈合要经历肉芽生成、血管新生、胶原沉积和组织重塑等阶段,而创伤中的新生血管为其提供营养物质和细胞因子以及排出代谢产物[3-4]。烫伤发生后创面缺血、缺氧致使HIF-1α表达升高,进而上调VEGF,VEGF能促进血管生成,改善局部微循环,从而加速创面愈合过程。rhGM-CSF作为组织工程产物,能趋化中性粒细胞、巨噬细胞、VEGF、HIF-1α、表皮生长因子、血小板衍生生长因子等活化或表达,一方面,控制创面炎症反应,而临床治疗中多直接选择复方环丙沙星[5]等抗菌药物对抗创面炎症反应,另一方面,启动细胞因子,加速局部血管化程度,改善微循环,进而促进创面愈合[6],并且在烫伤残余创面治疗上有独特的优势[7]。纳米银敷料是采用纳米技术,将单质银制成粒径约为25 nm的银微粒,银离子的缓慢释放使其具有持续杀菌、减轻创面感染的特点,烫伤创面可分泌大量基质金属蛋白酶,不利于创面的愈合,而纳米银抑制基质金属蛋白酶的作用促进了创面的愈合[8]。本研究结果提示,创面治愈率C组最快,A组最慢,在第10天,A组、B组、C组之间差异无统计学意义(P＞0.05),考虑为深Ⅱ度烫伤创面修复刚开始启动,各组自身优势相比不明显,第14,21天,A组、B组、C组之间差异有统计学意义(P＜0.05),证明B组、C组在促进创面愈合方面较A组有明显优势,并且rhGM-CSF比纳米银敷料在加速创面愈合方面作用更加突出。

深Ⅱ度烫伤发生后,皮肤及皮下毛细血管网在热力作用下损伤或栓塞,使组织局部缺血缺氧。缺血缺氧是诱导血管新生因子释放的最主要因素[9],低氧分压可诱导VEGF mRNA的表达[10]。VEGF是HIF-1α的一个重要靶基因,也是血管生成的主要调节因子[11],在缺氧条件下,VEGF能被HIF-1α诱导而转录激活,尤其是各种组织细胞在创伤及血管新生过程中。

VEGF是目前已知的一种最强的血管生成因子,其在正常组织中合成水平很低,但在外伤愈合过程VEGF可高表达[12],主要通过新生血管作用调节局部组织血管结构变化,以及血管源性水肿等生理、病理过程[13]。在病理及生理的血管生成中都是必不可少的诱导因子,其高效特异地作用于血管内皮细胞,有强烈的促分裂和趋化作用,形成血管萌芽和管腔,并可增强微血管通透性,诱导新血管形成[14]。本研究结果提示,A组VEGF水平在烫伤后一直逐渐上升,B组、C组逐渐上升,上升趋势较A组明显,第14天达到峰值,第21天水平下降,可能与B组、C组第21天创面溶痂完成,大部创面愈合,局部组织缺血缺氧逐渐改善,血管化程度有所降低有关,C组尤然。VEGF水平在第1天各组间差异无统计学意义(P＞0.05),说明烫伤早期创面发生应激性反应,机体修复机能未完全启动;第4, 7,10,14天各组间及第21天A组与C组之间差异有统计学意义(P＜0.05),在促进创面血管化方面,B组、C组优于A组,并且C组优于B组,即rhGM-CSF在促进深Ⅱ度烫伤创面血管新生方面有优势。

表2 3组深Ⅱ度烫伤大鼠血液VEGF水平Tab.2 Serum level of VEGF in three groups of rats with deepⅡdegree burn pg·mL-1,±s

表2 3组深Ⅱ度烫伤大鼠血液VEGF水平Tab.2 Serum level of VEGF in three groups of rats with deepⅡdegree burn pg·mL-1,±s

与A组同时间点比较,*1P＜0.05,与B组同时间点比较,*2P＜0.05Compared with group A at the same time point,*1P＜0.05;compared with group B at the same time point,*2P＜0.05

组别大鼠/只第1天第4天第7天第10天第14天第21天A组30 23.01±1.73 23.18±1.64 23.55±1.48 20.81±1.43 19.54±1.07 25.76±1.46 B组30 23.09±1.10 24.61±1.25*126.38±1.13*127.05±1.37*129.73±1.58*126.27±2.10 C组30 23.23±1.66 25.43±1.41*1*230.81±1.44*1*233.47±1.26*1*238.91±2.38*1*227.11±1.91*1

表3 3组深Ⅱ度烫伤大鼠创面H IF-1αm RNA相对表达量水平Tab.3 Relative expression of HIF-1αmRNA in wound surface of three groups of rats with deepⅡdegree burn ±s

表3 3组深Ⅱ度烫伤大鼠创面H IF-1αm RNA相对表达量水平Tab.3 Relative expression of HIF-1αmRNA in wound surface of three groups of rats with deepⅡdegree burn ±s

与A组同时间点比较,*1P＜0.05,与B组同时间点比较,*2P＜0.05Compared with group A at the same time point,*1P＜0.05;compared with group B at the same time point,*2P＜0.05

组别大鼠/只第1天第4天第7天第10天第14天第21天A组30 2.18±0.21 2.35±0.22 3.29±0.50 4.87±0.38 6.36±0.56 5.72±0.45 B组30 2.30±0.10*12.41±0.13 3.21±0.37 4.23±0.41*14.17±0.26*13.43±0.23*1C组30 2.28±0.17*12.44±0.15 3.01±0.33*13.78±0.22*1*23.57±0.19*1*22.75±0.32*1*2

HIF-1α是缺氧的特异感受因子,其基本作用是对缺氧产生适应性反应,反应细胞缺氧状态,调节氧平衡,通过转录活化编码VEGF基因[15],诱导VEGF的表达,从而促成血管新生。本研究结果提示,HIF-1α mRNA相对表达量,A组于伤后第14天出现高峰,第21天出现下降,而B、C组第10天出现高峰,第14天开始下降,可能与创面溶痂快慢、局部坏死组织脱落程度及缺血、缺氧程度有关,创面局部新生血管生成后使氧平衡得到改善,因此HIF-1α及其调控因子VEGF的表达相应下调[16-17]。第1天A组与B组、C组之间差异有统计学意义(P＜0.05),可能与rhGM-CSF和纳米银外用,趋化性的启动机体应激性反应,传递细胞信号,启动修复机制;第4天,A组损伤机制的启动,使差异无统计学意义;第10,14,21天各组间差异均有统计学意义(P＜0.05),证明rhGM-CSF和纳米银在促进创面溶痂,启动血管生成,改善局部缺血、缺氧,加速创面血管化方面比凡士林有明显优势,并且,rhGM-CSF比纳米银有优势。HIF-1α促进创面血管化机制可能与蛋白激酶C及磷脂酰肌醇激酶活化有关[18],启动HIF-1α转录,上调VEGF的表达,刺激血管新生。相关研究认为,HIF-1α通过诱导VEGF基因转录产生既能使缺氧细胞存活,改善微循环,完善供氧系统,又通过诱导P53等基因表达,促使细胞凋亡,降低耗氧量[19]。

烫伤创面外用敷料的研究逐渐趋向复合生物材料,rhGM-CSF和纳米银敷料外用均能改善深Ⅱ度烫伤创面血管化程度,但是rhGM-CSF优势更加明显。能否将二者联合应用,充分利用凝胶保湿和纳米银敷料的敷料架构作用,其相关发生机制需要进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.008

Effect of Recombinant Human Granulocyte/macrophage Colony-stimulating Factor and Nano-silver on Neovascularization in Healing Process of Skin with DeepⅡDegree Burn

YANG Jing-zhe,WEN Hai-ling,GENG Qi-ying,CHEN Feng-ping,FENG Xin-shu
(Department of Burns and Plastic Surgery,Affiliated Hospital ofChengde Medical College,Chengde 067000,China)

Objective To observe the effect of recombinant human granulocyte/macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF)and nano-silver as treatment for skin with deepⅡdegree burn.MethodsDeepⅡdegree burn Wistar rat model was established.The rats were randomly divided into three groups,petrolatum treatment group(group A,n=30),nanosilver treatmentgroup(group B,n=30),and rhGM-CSF treatmentgroup(group C,n=30).The pathological changes ofwound of the three groupswere observed 1,4,7,10,14 and 21 days after the treatment.The concentration of VEGF in serumswasmeasured with ELISA.The levels of HIF-1αmRNA expression were detected by RT-PCR.ResultsOn day 10,neovascularization developed in groups A,B and C.Healing rate of the wound was the highest in group C,lowest in group A,with significant differences among the three groups on day 14 and day 21(P＜0.05).VEGF level peaked on day 14 in group A,and on day 10 in groups B and C.There were significant differences in VEGF level on day 1 between group A and groups B,C,on day 7 between group A and group C,on day 10,14 and 21 among the three groups(P＜0.05),but no significant differences on day 4 among the three groups.ConclusionrhGM-CSF and nano-silver treatment can accelerate neovascularization of wound,and rhGM-CSF is better than nano-silver.

Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor;Nano-silver;Burn wound;Vascular endothelial growth factor;Hypoxia inducible factor

R986;R644

A

1004-0781(2014)12-1570-05

2013-12-23

2014-06-11

*河北省2013年医学科学研究重点课题计划指令性课题(20130024);承德市科学技术研究与发展计划项目(20122164)

杨景哲(1980-),男,河北承德人,主治医师,硕士,主要从事烧伤创面愈合机制研究。电话:0314-2279277,E-mail:sanyue_1@sina.com。

耿琪瑛(1954-),女,河北承德人,主任医师,教授,学士,研究方向:烧伤难愈性创面治疗及异体皮临床应用。电话:0314-2279276,E-mail:sanyue_1@aliyun.com。