TGF-β/Smad与Wnt/β-catenin在博莱霉素致大鼠肺纤维化中的表达及相互作用

肖 颖，杨涛涛，周卫民，朱科燕，寿旗扬，蔡月琴，陈方明，陈民利

（浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053）

TGF-β/Smad与Wnt/β-catenin在博莱霉素致大鼠肺纤维化中的表达及相互作用

肖 颖，杨涛涛，周卫民，朱科燕，寿旗扬，蔡月琴，陈方明，陈民利

（浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053）

目的观察TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路相关基因在肺纤维化大鼠模型肺组织中的表达，探讨两条通路对肺纤维化的影响及其相互作用。方法取Wistar大鼠36只，随机分为正常对照组和肺纤维化模型组，每组18只。采用气管内注入博来霉素（BLM）建立Wistar大鼠肺纤维化模型，每组分别于第14、21和28天处死大鼠各6只；取肺组织称重，测定肺组织中HYP、IL-1β水平，观察肺组织Col-I、IL-1β、TGF-β1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1 mRNA的表达，并进行HE染色和Masson胶原染色。结果（1）与正常对照组比，造模后14～28d大鼠肺指数均明显升高（P＜0.01）；肺组织HE染色呈现明显的肺纤维化病理改变，Masson染色结果可见造模后14～28d肺间质蓝色胶原呈渐进性增加。（2）造模后第14天，肺组织IL-1β含量、IL-1β mRNA相对含量均显著升高（P＜0.01），随后逐渐降低，至造模后第28天IL-1β表达量接近正常水平（P＞0.05）。（3）造模后14～28d大鼠肺组织HYP含量、Col-I mRNA相对表达量均明显升高（P＜0.01）。（4）与正常组相比，模型组中TGFβ1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-Catenin、LEF-1 mRNA表达显著增加（P＜0.01），且TGFβ1、Smad3 mRNA分别与Wnt1、LEF-1、β-catenin mRNA的表达呈显著正相关。结论TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路相关基因在博来霉素致大鼠肺纤维化中表达上调，两条通路对肺纤维化可能有促进作用且它们间可能存在一定联系。

博莱霉素；肺纤维化；TGF-β1；β-catenin

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性间质性肺部疾病，是以弥漫性肺泡炎、肺泡结构紊乱、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）大量沉积等为特征的组织病理学改变［1］。肺纤维化发病过程主要分为两个阶段，前期炎症反应阶段和后期纤维化阶段［2］，并认为肺纤维化是由肺组织受损后修复调节失控、重建异常所引起的病变，是一系列细胞因子、生长因子通过多条细胞信号转导通路共同调控的结果［3］。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）被认为是最为关键的致纤维化因子之一，它主要通过TGF-β/Smad通路而在肺纤维化过程中发挥作用［4］。博莱霉素（bleomycin，BLM）致大鼠肺纤维化模型病理学改变与人类肺纤维化十分相似，是当今比较公认的致模方法［5］。最近研究发现，Wnt/β-catenin通路的活化可促进纤维化疾病的发生［6］，且TGF-β/Smad通路和Wnt/β-catenin通路间存在一定联系［7］，但目前关于Wnt通路在大鼠纤维化中的研究较少，同时TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin两条途径的相关基因在BLM致大鼠肺纤维化模型中表达变化情况尚未见报道。因此，本文采用气管内注射博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型，观察造模后14、21、28d大鼠肺组织TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路中相关基因的表达，探讨两条通路在博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中的作用及相互关系，为该模型在肺纤维化研究中的应用奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验动物与饲养环境

SPF级雄性Wistar大鼠，6～7周龄，体重（200～220）g，36只，来源于上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK（沪）2012-0002］；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障环境［SYXK（浙）2012-0001］，饲养室温度：（20±2）℃，相对湿度：50％～60％，光照：12h/12h明暗交替；每笼3只饲养，自由饮食；并在实验过程中按实验动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

注射用盐酸博莱霉素，日本化药株式会社；Masson三色染色试剂盒，珠海贝索生物技术有限公司；羟脯氨酸（HYP）、TGFβ1、白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒，杭州诚维科技公司；总RNA提取裂解液（RNAiso plus）、RT-PCR反转录试剂盒和荧光定量试剂均购于大连Takara公司；PCR引物由上海生工生物公司合成。Nikon生物倒置显微镜（日本Nikon公司）、连续光谱酶标仪（美国Thermo公司）、Nano-drop微量核酸测定仪（美国Thermo公司）、PTC-200定性PCR仪（美国Bio-Rad公司）、IQ5荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 动物分组与模型制备

取体重（200～220）g的雄性Wistar大鼠36只，适应性饲养1周后，随机分为正常对照组（control）和模型组（model），每组18只。参照Szapie等［8］方法进行造模，模型组大鼠用3％戊巴比妥钠溶液45mg/kg腹腔注射麻醉，微创暴露气管，大鼠气管内注入博莱霉素（5mg/kg）水溶液0.2mL～0.3mL，正常对照组麻醉后气管内注入等量生理盐水，注射完毕后立即将大鼠直立旋转30s，尽量使药液在肺内均匀分布，每组分别于造模后14d、21d和28d取大鼠6只大鼠，称重后用3％戊巴比妥钠溶液45mg/kg腹腔注射麻醉，开胸取肺组织，用滤纸吸去表面血液和体液后称重，计算肺指数；并取一侧肺组织置于10％中性甲醛中固定；另一侧肺组织分成一式3份保存于-80℃，用于分子检测。

1.4 肺组织病理学观察

肺组织经10％中性甲醛固定后，按常规病理方法脱水、包埋、切片，进行HE、Masson染色，光学镜下观察肺组织病理学改变；参照Szapie等［8］的方法用Masson染色评定肺组织纤维化程度。

1.5 肺组织中HYP、IL-1β含量测定

取冻存肺组织300mg，分别装入EP管，加入PBS液，冰水中用超声细胞粉碎机做组织匀浆，离心15min，取上清液，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定肺组织匀浆液HYP和IL-1β含量。

1.6 肺组织纤维化相关细胞因子mRNA表达

取冻存肺组织50mg～80mg，按Trizol试剂盒说明书操作，提取总RNA并逆转录成cDNA。基因引物由上海生工生物公司设计并合成，引物序列见表1。将cDNA用RT-PCR仪进行扩增，所有反应信息资料由Bio-Rad iQ5 PCR仪收集，CT值通过计算机软件测定，转录水平通过公式2-ΔΔCT计算。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 肺组织大体观察

通过气管内注入BLM后，大鼠体型明显消瘦（P＜0.01），体重增加缓慢，至造模后第28天大鼠体重与正常组相比仍存在显著差异（P＜0.01）（图1）。解剖观察发现正常组大鼠肺脏呈淡红色，表面光滑，弹性良好，未见出血点；造模后14d肺组织呈黄白色，局部见大小不等结节样改变，双肺表面见出血点和瘀斑；造模后21d，肺组织呈灰白色，双肺表面出血点较14d有所减少，出现有少许较浅凹沟；至造模后28d肺组织体积缩小，质地变硬，颜色苍白，表面粗糙不平，可见小片状、条索状凹凸不平的苍白凹沟。图1结果显示，与正常对照组比，大鼠造模14d后肺指数显著升高（P＜0.01），造模后第21天和第28天肺指数虽有所下降，但仍显著高于正常对照组（P＜0.01）。

2.2 肺组织病理学观察

HE染色结果显示，正常对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡间隔未见增厚，无水肿、炎症及纤维化表现。模型组大鼠造模后第14天，肺泡腔和肺间质有炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚，有纤维结缔组织增生，肺泡腔变窄，出现纤维化；造模后第21天，肺泡炎较14d时有所减轻，少量炎症细胞浸润，成纤维细胞大量增生，纤维组织呈条索样瘢痕改变；造模后第28天，肺组织仅有少量炎症细胞浸润，肺泡结构破坏、萎缩或消失，成纤维细胞大量增生，纤维组织呈斑片状分布（图2-a，图2见封底）。Masson染色结果，正常对照组大鼠肺组织中未见蓝色胶原沉积，而造模后第14天有少量蓝色胶原沉积，随时间延长蓝色胶原呈进行性增多，至第21、第28天肺间质出现大量的蓝色胶原沉积（图2-b，图2见封底）。

2.3 肺组织IL-1β含量和IL-1βmRNA的表达

由图3可见，与正常对照组比，模型组肺组织中IL-1β含量、IL-1β mRNA相对表达量均在造模后第14天明显升高（P＜0.01），此后均有所降低，至造模后第28天时IL-1β含量仍高于正常对照组（P＜0.05），但IL-1β mRNA表达量已降为正常水平（P＞0.05）。

注：与正常对照组比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。（a）模型组大鼠体重增加缓慢，与正常组相比存在显著差异（P＜0.01）。（b）与正常组相比，大鼠造模14d后肺指数显著升高（P＜0.01），造模后第21天和第28天肺指数虽有所下降，但仍显著高于正常对照组（P＜0.01）。图1 肺纤维化大鼠体重和肺指数的变化（n=6）Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.normal control group.（a）In the model groups，the body weight increased slowly and significantly different from that of the normal group（P＜0.01）.（b）Compared with the normal group，the lung index was significantly increased on 14 days after bleomycin administration.The lung index was decreased 21 and 28 days after model building，but were still significantly higher than that in the control group.Fig.1 Changes of the body weight and pulmonary index of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rats

注：与正常对照组比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。模型组IL-1β含量、IL-1β mRNA相对含量在造模后第14天升高（P＜0.01），第28天时IL-1β含量仍高于正常组（P＜0.05），IL-1β mRNA表达量降为正常水平（P＞0.05）。图3 大鼠肺组织IL-1β含量和IL-1β mRNA相对含量的比较（n=6）Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.normal control group.Compared with the normal groups，the content of IL-1β and expression of IL-1β mRNA are significantly increased after operation（P＜0.01），and then declined.On 28 days after model building the contents of IL-1β remain higher than those in the normal groups，while the expression of IL-1β mRNA is near the normal level（P＞0.05）.Fig.3 Comparison of IL-1β content and mRNA expression of IL-1β in the lung tissue of rats

2.4 肺组织HYP含量、Col-ⅠmRNA表达

与正常对照组比，模型组肺组织中HYP含量、Col-I mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01），且造模后第14天至第28天时肺组织中HYP含量、Col-I mRNA相对表达量均呈持续性显著上升（P＜0.01），见图4。

2.5 TGF-β/smad和Wnt/β-catenin通路相关基因表达及其相关性分析

与正常对照组比，给予博莱霉素后第14天肺组织中TGFβ1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1 mRNA相对表达量均显著升高（P＜0.01），之后逐渐下降，但均显著高于正常对照组（P＜0.01），见图5。肺组织中TGFβ1 mRNA表达与Wnt1，β-catenin，LEF-1 mRNA表达呈显著正相关，相关系数分别为0.650、0.730、0.747（P＜0.01）；Smad3 mRNA与Wnt1，β-catenin，LEF-1 mRNA表达趋势一致，其相关系数分别为0.727、0.813、0.764（P＜0.01）；此外，α-SMA mRNA表达与TGFβ1，Smad3，Wnt1，βcatenin及LEF-1 mRNA表达呈显著性正相关，相关系数分别为0.721、0.843、0.812、0.673、0.755（P＜0.01），见图5。

注：与正常对照组比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。模型组HYP含量、Col-ⅠmRNA表达水平均显著升高（P＜0.01），造模后14～28d HYP含量、Col-I mRNA相对表达量均持续上升。图4 大鼠肺组织HYP含量、Col-ⅠmRNA相对含量的比较（n=6）Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.normal control group.Compared with the normal groups，the contents of HYP and Col-I mRNA are significantly increased after operation（P＜0.01），and continue to increase during 14 to 28 days after model building.Fig.4 Comparison of HYP，Col-I mRNA contents in the lung tissues of rats.

注：与正常对照组比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。模型组TGFβ1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1 mRNA相对含量显著升高（P＜0.01），造模后14～28天逐渐下降，28d时仍显著高于正常对照组（P＜0.01）。图5 大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1mRNA表达情况比较（n=6）Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.normal control group.Compared with the normal groups，the expression of TGF-β1，Smad3，α-SMA，Wnt1，β-catenin，LEF-l are significantly increased after operation（P＜0.01），and then decline.On the 28 days after model building the level remains higher than that in the normal groups（P＜0.01）Fig.5 Comparison of the expression of TGF-β1，Smad3，α-SMA，Wnt1，β-catenin and LEF-1 in the lung tissue of rats.

3 讨论

肺纤维化是许多肺系慢性疾病后期的共同结局，其病理特点是早期肺泡炎和后期成纤维细胞大量增生及胶原进行性沉积并取代正常的肺组织结构［1］。博莱霉素致大鼠肺纤维化模型病理学改变与人类肺纤维化极为相似［5］。有文献报道［2］，大鼠气管内注入BLM后，纤维化疾病发展基本上可以分为三个阶段，炎症反应阶段（造模后3～7d），间质细胞增生阶段（造模后7～14d）和弥漫性纤维化阶段（造模后14～28d）。本实验通过气管内注入博莱霉素建立大鼠肺纤维化模型，研究结果发现造模14d后IL-1β含量和mRNA表达量均明显升高，随后逐渐降低，至造模后第28天时IL-1β mRNA相对表达量几乎接近正常水平。另外，HE染色结果可见造模后14～28d炎性细胞浸润明显减少，提示BLM诱导大鼠肺纤维化后期炎症反应逐渐减弱。胶原代谢处动态平衡对维持肺泡正常结构和功能有着十分关键的作用，肺纤维化的改变主要为胶原代谢失衡，其中Col-I型和Col-III型代谢失衡起主要作用，肺组织中Ⅲ型胶原过度沉积能够逆转，而Ⅰ型胶原的过度沉积将导致不可逆的肺纤维化［9］。HYP是机体胶原蛋白的主要成分之一，且为胶原蛋白所特有，其含量可作为胶原组织代谢的重要指标，常用于判断肺纤维化程度。本实验结果显示，造模后第14天至第28天期间肺组织中HYP含量和Col-I mRNA的表达量均显著升高，肺组织Masson染色结果亦发现造模后第14天胶原纤维明显增生，且胶原沉积随时间的延长而呈进行性增加。由此可见，BLM可诱导大鼠形成明显肺纤维化，并且BLM致大鼠纤维化后期是以肺间质纤维化为主，与文献报道相一致。

TGF-β1被公认为是纤维化形成与发展的启动枢纽，能促进成纤维细胞趋化，促使胶原合成和改变细胞外基质成分。Smads蛋白是TGF-β下游信号转导和调节分子，磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4形成Co-Smads入核调控靶基因转录，从而诱导纤维化改变［10］。Wnt/β-catenin通路是调控细胞增殖、分化的重要途径，β-catenin是Wnt通路中关键的信号转导分子，创伤等诱因激活Wnt蛋白表达分泌，使得β-catenin无法磷酸化，游离的β-catenin在细胞浆蓄积到一定量后，进入细胞核与TCF/LEF结合，从而激活靶基因转录［11］。近来研究表明，Wnt/β-catenin通路的激活可导致肺纤维化形成［12］。TGF-β/smad与Wnt/β-catenin通路在多个环节存在交互作用［13］。在人类真皮成纤维细胞中，TGF-β和Wnt信号转导通路可以共同调节胶原、基质金属蛋白酶等的表达，TGF-β1作用于皮肤成纤维细胞后，可诱发β-catenin表达升高［14］。本研究结果显示，模型组中TGFβ1、β-catenin、Col-1 mRNA相对含量均显著高于正常组，且造模第14～28天，TGF-β1与β-Catenin mRNA变化趋势一致，呈显著性正相关，说明TGFβ1可能通过激活β-catenin表达从而促进BLM致肺纤维化过程。此外，TGFβ1可以通过Smad3和Smad4激活淋巴细胞增强因子（TCF/LEF）转录目的基因，而TCF/LEF是Wnt通路下游信号转导分子，它可以刺激基质金属蛋白酶和结缔组织大分子等的表达调节纤维化［15］。本实验检测亦发现造模后第14天TGFβ1、Smad3和LEF-1 mRNA的表达量均明显升高，至21d和28d时其表达量有所降低且存在一定相关性，提示TGFβ1可能通过其下游信号分子Smad3实现对Wnt通路中LEF的表达上调而导致肺纤维化形成。近年来研究证实［16］，肌成纤维细胞与肺纤维化发生、发展密切相关，上皮间质转化（EMT）是肌成纤维细胞细胞来源的一个重要途径。另有文献表明［17］，TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路均可促使EMT发生。本实验结果发现，模型组中，α-SMA、TGFβ1、Smad3、Wnt1、β-catenin和LEF-1 mRNA表达都高于正常对照组，且它们变化情况均与α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）存在显著性正相关，α-SMA的大量表达是肌成纤维细胞细胞分化的一个重要标志［16］，故我们推测TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin途径可能通过共同促使EMT发生从而诱导肌成纤维细胞分化而达到致肺纤维化作用。

综上所述，在博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程，TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路中相关基因表达上调，说明这两条通路的活化可能导致纤维化发生，它们间也许存在一定的联系。TGFβ1可能通过激活β-catenin，进而使得成纤维细胞中胶原过度分泌，影响肺纤维化形成；同时TGFβ1也可能通过Smads蛋白调节Wnt通路下游信号分子LEF活性，进而上调基质金属蛋白酶和其它结缔组织大分子的表达促进纤维化进程；此外TGFβ和Wnt通路还可能通过共同激活EMT发生导致肌成纤维细胞大量产生达到促肺纤维化作用。目前关于这两条通路在肺纤维化中作用及相互间关系的研究还处于初步阶段，其具体机制有待我们进一步确认及深入研究。

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Expression and interaction of TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin signaling pathway-related genes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats

XIAO Ying，YANG Tao-tao，ZHOU Wei-min，ZHU Ke-yan，SHOU Qi-yang，CAI Yue-qin，CHEN Fang-ming，CHENmin-li
（Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

ObjectiveTo observe the expression of TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin signaling pathway-related genes in the lung tissue and explore the function and interaction of the two pathways in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats.MethodsThirty-six male Wistar rats were randomly divided into two groups，the control group（n=18） and model group（n=18）.The rats were intratracheally injected with saline and bleomycin solutions，and killed on the 14th，21st and 28th days after operation，respectively.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to determine the levels of HYP and IL-1β in the lung tissues.Real-time PCR was used to detect the expression of IL-1β，Col-I，TGF-β1，Smad3，α-SMA，Wnt1，β-catenin，and LEF-1mRNA in the lung tissues.Histopathological examination of thelung tissues was done with hematoxylin-eosin（HE）and Masson staining.Results（1）Compared with the normal group，the lung indexes were significantly increased during the 14 to 28 days after bleomycin administration（P＜0.01）.The pathological changes were in accordance with pulmonary fibrosis，and the blue collagens by Masson staining were gradually increased in the pulmonary interstitium at 14 to 28 days after model building.（2）Compared with the normal group，the IL-1β content and the expression of IL-1β were significantly increased on the 14th day after bleomycin administration（P＜0.01）and then declined gradually，and on the 28 day the expression of IL-1β was near to the normal level（P＞0.05）.（3）At 14 to 28 days after operation，the content of hydroxyproline and the expression of Col-I were increased successively，and were significantly higher than those in the control group（P＜0.01）.（4）Compared with the normal group，the expression of TGF-β1，Smad3，α-SMA，Wnt 1，β-catenin，LEF-l were significantly increased after operation（P＜0.01），and there was a significant positive correlation between them.ConclusionsThe expression of TGF-β/Smad and Wnt/βcatenin pathway-related genes are increased in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats.The two pathways may promote the process of fibrosis and there may be some relationship between them.

BLM；Pulmonary fibrosis；TGF-β1；β-catenin；Rat

R33

A

1671-7856（2014）02-0063-07

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.014

“浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目”资助（编号：ZWR2008-43）。

肖颖（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向：中药药理与比较医学。E-mail：zhulinfengsmile@163.com。

陈民利（1963-），女，教授、硕士，研究方向：实验动物与比较医学，E-mail：cmli991@aliyun.com。

2013-12-12