自体骨髓间充质干细胞移植对脑出血患者血清S100β、GFAP的影响

王万宏，王亚林，卢庆韬

自体骨髓间充质干细胞移植对脑出血患者血清S100β、GFAP的影响

王万宏1，王亚林1，卢庆韬2

（1.唐山市丰南区医院神经外科，河北唐山063300；2.唐山市工人医院分院外科）

非创伤性脑出血最常见的原因为高血压性脑出血。长期的高血压导致脑动脉粥样硬化，脑动脉粥样斑块形成。当遇诱发因素存在时，血压骤然升高，从而导致脑出血发生。大多数脑出血患者都有脑组织损伤和神经功能缺损。促进受损脑组织修复是当前脑出血治疗的主要任务。以往研究表明，自体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植能改善神经功能缺损程度并提高日常生活活动能力［1，2］，但对脑出血患者脑组织损伤血清标志物的影响尚未见报道。本研究观察自体MSCs移植对脑出血患者血清S100β、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的影响，为脑出血的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2010年1月－2013年7月我院收治的脑出血患者60例为研究对象，均行钻孔引流术，术后1周行自体骨髓间充质干细胞移植30例为观察组，行常规治疗30例为对照组。观察组：男18例，女12例；年龄40.5－68.0岁，平均年龄（54.0±6.5）岁；CT定位出血均为基底核区；出血量：20－30ml 10例，30－50ml 13例，＞50ml 7例；患肢肌力0级9例，Ⅰ－Ⅱ级12例，Ⅲ－Ⅳ级9例。对照组：男19例，女11例；年龄41.0－67.5岁，平均年龄（54.3±6.2）岁；CT定位出血均为基底核区；出血量：20－30ml 9例，30－50ml 13例，＞50ml 8例；患肢肌力0级10例，Ⅰ－Ⅱ级11例，Ⅲ－Ⅳ级9例。两组患者性别、年龄、出血部位、出血量、患肢肌力等资料比较，差异无统计学意义，具有可比性。

1.2纳入及排除标准

纳入标准：①年龄＜80岁，发病后有失语、偏瘫、运动障碍等神经功能缺损症状；②有钻孔引流手术指征；③取得患者家属的知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①年龄≥80岁，有严重过敏史的过敏体质者；②合并心、肝、肾等其他脏器严重功能障碍者；③凝血机制障碍者；④对MSCs移植治疗期望过高，有不切实际要求者。

1.3骨髓采集

患者进手术室于局部麻醉下行骨髓穿刺术，以髂后上棘为穿刺点，30号骨髓穿刺针进行穿刺，20 ml干燥无菌注射器于两侧髂后上棘共抽取120－180 ml骨髓，注入细胞培养液中，迅速送至无菌细胞培养室。骨髓穿刺术后将患者送入ICU重症监护室，注意监测生命体征［3］。

1.4MSCs的分离和培养

MSCs分离：无菌采集抗凝骨髓120－180ml；消毒采血袋壁及输液管，将试剂A液、B液均加至骨髓液中，静置40min；吸取上层液体转移至离心管，以1 500rpm转速离心10min；弃上清，将适量C液加入各离心管中，吹打混匀细胞制成细胞悬液，离心10min；用吸管将细胞层转移至另一离心管中，加入适量A液，以1 500rpm转速离心5min；弃上清，以1 800rpm离心5min；吸取少量细胞悬液，滴于细胞计数板，显微镜下观察计数。MSCs培养：调整细胞密度为1.0×107／ml接种于细胞培养瓶中，置于37℃，含5%CO2饱和湿度的细胞培养箱；培养至第4d，去除未贴壁的悬浮死细胞，换完全细胞培养液；每3d换液1次，待细胞生长融合达瓶底面积的80－90%时，加入含0.25%胰蛋白酶的消化液2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱消化约1min，取出培养瓶，显微镜下观察，见细胞收缩成类圆形的细胞，加入中和胰蛋白酶3ml于培养液中，以防过度消化。把溶液倒入离心管中，加入完全培养液反复吹打，吸弃气泡，以1 500rpm转速离心5min，弃上清，反复吹打后，加入完全培养液5ml，调整细胞数为5×105／ml，移到细胞培养瓶中培养5－7d。按1∶2比例传代，2－3d换液一次，期间观察待细胞基本融合后，用0.25%胰蛋白酶5ml溶解，往培养液中加入完全培养液，吹打制备单细胞悬液［4］。

1.5 MSCs的移植

患者躺于平板床上，取左侧卧位，屈髋屈膝，头尽量曲向前胸，背部与床面垂直；穿刺点选择3－4腰椎棘突间隙。常规消毒，铺无菌洞巾，以2%利多卡因3ml行局部浸润麻醉，麻醉至椎间韧带，以9号穿刺针以垂直背部方向自穿刺点刺入约5cm左右，待针尖抵抗感消失，缓慢拔出针芯。无色透明的脑脊液流出表示穿刺成功，将MSCs细胞悬液5ml缓慢注入蛛网膜下腔，穿入针芯，拔出穿刺针，无菌纱布覆盖，胶布固定，嘱患者去枕平卧6h。

1.6血清S100β、GFAP检测方法

采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清S100β、GFAP，试剂盒均购自北京尚柏生物工程公司，严格按试剂盒说明进行操作。具体步骤：自密封袋中取出ELISA板并标记；分别加入10μl标准品、10μl血清于板孔中，轻轻混匀，每孔加入200μl抗体，混匀30s，37℃温育30min；洗涤反应板5次，每孔加入100μl HRP，混匀10s，37℃温育30min；洗涤反应板5次，每孔加入200μl TNB显色液，混匀后室温温育20min；每孔加入100μl终止液，轻轻混匀30s，30min内在450nm处读OD值；制标准曲线，确定血清样品S100β、GFAP浓度。

1.7统计学处理

采用SPSS18.0软件包进行统计，计量资料结果以均数±标准差（x—±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1自体MSCs移植对脑出血患者血清S100β的影响对照组和观察组患者血清S100β蛋白含量在干预1d、4d、7d均呈递减趋势（P＜0.05）；干预前及干预后1d观察组患者血清S100β蛋白与对照组差异无统计学意义，干预后4d、7d值均低于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 自体MSCs移植对脑出血患者血清S100β的影响（x—±s，n＝30）

2.2自体MSCs移植对脑出血患者血清GFAP的影响两组干预后1d、4d、7d血清GFAP呈时间依赖性降低（P＜0.05）；观察组干预后4d、7d血清GFAP值均低于对照组，见表2。

3 讨论

脑出血发病率较高，占急性脑血管疾病的20%－ 30%，其中高血压性脑出血是非创伤性脑出血的最常见原因。研究表明，在脑出血早期阶段，某些血清生化标志物可用来判断神经功能损害程度及范围，甚至优于CT及MRI等影像学检查［5］。星形胶质细胞是中枢神经系统分布最广的细胞，不仅能支持、营养神经元，而且参与宿主防御及组织修复。GFAP为星形胶质细胞中的主要的中间丝蛋白［6］。S100β蛋白存在于神经胶质细胞、星型细胞、少突胶质细胞中。当中枢神经受损时，S100β和GFAP溢出并通过血脑屏障进入血液。两者参与中枢神经系统损伤后的病理变化，可作为中枢神经系统损伤早期病情监测的血清标志物。

表2 自体MSCs移植对脑出血患者血清GFAP的影响（x—±s，n＝30）

MSCs来源于中胚层，是一种多潜能干细胞，对中枢神经系统损伤或创伤修复具有一定作用。李计成［7］等对20例脑出血患者实施自体MSCs移植，发现移植后6个月患者神经功能缺损程度评定（NIHSS评分）和日常生活活动能力评定（Barthel指数）均明显提高，且具有安全性。朱建新［8］对32例脑出血患者进行自体MSCs移植治疗，证实其对脑出血患者安全可行，近期疗效确定。本研究进一步观察自体MSCs移植对脑出血患者血清S100β、GFAP的影响，结果显示：①观察组在脑出血1周接受自体MSCs移植后1d、4d、7d血清S100β蛋白依次降低，每一时间点S100β蛋白均低于对照组水平；②两组干预后1d、4d、7d血清GFAP呈时间依赖性降低；观察组干预后1d、4d、7d血清GFAP值均低于对照组。研究结果在分子水平证实，自体MSCs移植能减少血清神经细胞损伤标志物S100β、GFAP的水平，间接表明MSCs移植存活后，可多向分化为神经细胞，发挥促进神经组织修复、神经功能恢复的作用。

综上所述，MSCs不仅取材方便，无免疫原性，而且体外扩增迅速、可自体移植。能通过降低脑出血患者血清S100β、GFAP水平，促进脑出血患者神经细胞损伤的修复。

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2014－01－14）

1007－4287（2014）12－2011－03