荧光PCR检测CYP2C19基因分型与氯吡格雷临床疗效的相关性研究

金 欣，陈水平，左向华，佟利威，袁 方，许晓跃，吴海涵，李占甲，张 伟，黄 媛，尹秀云，于 农

荧光PCR检测CYP2C19基因分型与氯吡格雷临床疗效的相关性研究

金 欣，陈水平，左向华，佟利威，袁 方，许晓跃，吴海涵，李占甲，张 伟，黄 媛，尹秀云，于 农＊

（中国人民解放军第三○七医院检验科，北京100071）

目的通过分析CYP2C19基因型与ADP抑制率之间的关系，探讨CYP2C19基因分型与氯吡格雷抗凝治疗效果的关系。方法选取急性冠脉综合征（ACS）并成功接受经皮冠状动脉介入治疗术（PCI）的患者55例，收集患者EDTA抗凝静脉血提取血液基因组DNA，用实时荧光PCR方法分析CYP2C19基因型，测定每名患者ADP抑制率，用统计学方法分析CYP2C19不同基因型患者ADP抑制率的差异。结果所有入组患者根据基因型不同分为快代谢组占49.09%（27／55），中等代谢组占38.19%（21／55），慢代谢组占12.73%（7／55）。三组ADP抑制率比较，两两相比差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗存在关联，快代谢型患者PCI术后服用氯吡格雷疗效好于携带基因突变的患者，慢代谢型患者PCI术后服用氯吡格雷疗效差。

CYP2C19；氯吡格雷；荧光PCR；ADP抑制率

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1948）

抗凝药物是心血管疾病常用的临床药物，氯吡格雷就是其中最具代表性的药物之一。它是二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）受体拮抗剂，通过抑制ADP对血小板的诱导作用产生抗凝作用，是冠心病患者长期服用的抗血小板聚集药物，体内代谢主要受基因CYP2C19调控。由于每个个体对氯吡格雷治疗的反应性不同，部分患者尽管长期服用常规剂量的氯吡格雷（75mg），临床上仍不能有效的抑制血小板聚集，不能有效的预防血栓性事件的发生，临床常将此现象称为氯吡格雷抵抗（clopidogrelresistance，CR）［1］。

本研究对心内科接受经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）的患者通过荧光PCR方法检测CYP2C19的基因型并检测患者血栓弹力图，通过分析CYP2C19基因型与ADP抑制率之间的关系，探讨CYP2C19基因分型与氯吡格雷抗凝治疗效果的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2013年5月－2014年7月我院心内科住院的急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）患者55例，入选标准为：冠状动脉造影显示至少一支血管狭窄程度为75%以上，并成功接受PCI治疗。所有患者肝肾功能正常，术后服用硫酸氢氯吡格雷片（75mg／日）抗血小板聚集。

1.2CYP2C19基因分型血液基因组提取试剂盒为天根生化科技公司，DNA检测试剂为苏州旷远生物技术有限公司生产的人CYP2C19基因分型检测试剂盒，检测方法为实时荧光PCR法。取500lEDTA抗凝静脉血，提取基因组DNA。48h内检测2－8℃保存，长期保存－80℃。

按照试剂盒说明书在罗氏480上进行荧光PCR扩增，每份标本采用4管独立的PCR反应体系，分别检测CYP2C19 681G、681A、636G、636A等位基因。结果判断见表1。

1.3TEG血小板图试验TEG血小板图试验监测氢氯吡格雷（ADP类）的抗PLTs效果，使用肝素抗凝全血测定，检测仪器为TEG Hemostasis Ana－lyzer Model 5000Series，ADP类激活剂为原厂配套试剂。

1.4统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以x—±s表示，不同基因型组间的比较采用单因素方差分析，P≤0.01差异有统计学意义。

2 结果

2.1实时荧光PCR检测CYP2C19基因分型结果判读及各组例数见表1。快代谢组占49.09%，中等代谢组占38.19%，慢代谢组占12.73%。

2.2PCI治疗患者中CYP2C19基因分型与ADP抑制率之间的关系，见表2。慢代谢组7名患者ADP抑制率均小于20%，中等代谢组中95.24%的患者ADP抑制率小于50%，快代谢组中有14.81%的患者ADP抑制率小于50%，85.19%的患者ADP抑制率大于50%。

表1 实时荧光PCR法检测CYP2C19基因型结果

表2 PCI治疗患者中CYP2C19基因分型与ADP抑制率之间的关系

3 讨论

氯吡格雷作为一种新型的噻吩吡啶类衍生物，是一种前体药物，需要通过氧化作用形成2－氧基－氯吡格雷，然后再经过水解形成活性代谢物（一种硫醇衍生物）。这一活性转化主要依赖于肝脏CYP450氧化酶作用，其中最主要的亚族为CYP2C19，使氯吡格雷在体内有效地转化为发挥药物作用的活性形式。已经发现编码正常酶活性的基因是CYP2C19＊1，中国人群CYP2C19突变类型几乎均为CYP2C19＊2和CYP2C19＊3，这两种突变是低功能代谢型，从而对氯吡格雷在体内对抗血小板聚集疗效产生重要影响。本研究通过检测PCI术后患者血栓弹力图中氯吡格雷对血小板ADP抑制率的影响，探讨CYP2C19不同基因型人群与氯吡格雷抗凝疗效的关系。

氯吡格雷是目前国内唯一批准上市的噻吩吡啶类抗血小板药物，是PCI术后不可或缺的药物之一。2011年美国心脏病协会（ACC／AHA）发布的ACS患者管理指南中均建议阿司匹林及氯吡格雷双重抗血小板药物作为常规治疗。有研究表明［2］CYP2C19＊2携带者在PCI支架置入术后发生支架内血栓的概率会明显升高。对健康受试者服用氯吡格雷的研究表明［1］，携带1个功能缺失等位基因的患者，其血浆氯吡格雷代谢浓度较非携带者降低32.4%。CYP2C19基因多态性是引起氯吡格雷抵抗的重要因素，美国食品与药品管理局（FDA）黑框警示“使用氯吡格雷前注意CYP2C19的基因型”［3］，但有部分研究反对上述观点［4，5］。研究者通过Meta分析得出CYP2C19基因多态性与氯吡格雷的临床疗效无实质性关系［4］。

本研究对入组患者根据CYP2C19基因型的不同分成三组，CYP2C19＊1／＊1属于野生型，是快代谢组，CYP2C19＊2／＊2，CYP2C19＊3／＊3，CYP2C19＊2／＊3这3种基因型的患者两个等位基因同时携带低功能代谢基因，是慢代谢组。CYP2C19＊1／＊2，CYP2C19＊1／＊3这两种基因型属于中等代谢组。由于慢代谢组患者两个等位基因同时携带低功能代谢基因，会导致氯吡格雷代谢活性降低，抗血小板聚集效果不佳，因此慢代谢组ADP抑制率会显著低于快代谢组和中等代谢组。根据文献报道［6，7］，ADP诱导下血小板聚集50%为阈值，即ADP抑制率小于50%时患者对氯吡格雷不敏感，抗血小板聚集效果不佳，会导致血栓事件。本次入组的慢代谢患者ADP抑制率100%小于20%，与快代谢组和中等代谢组有显著性差异，提示CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗存在关联。

CYP2C19基因多态性检测方法包括DNA直接测序法［8］、等位基因特异PCR［9］和基因芯片技术［10］等。但这些方法费时费力，难以用于临床实验室常规检测。荧光PCR方法检测CYP2C19灵敏性好、特异性高、操作简便，具有很好的临床应用前景。

总之，临床医师应重视ACS患者行PCI治疗后对氯吡格雷反应的表现，在开始应用氯吡格雷之前，可以考虑进行基因检测，在应用氯吡格雷之后定期检测TEG血栓弹力图，有助于明确患者是否存在携带氯吡格雷低功能代谢基因，降低各类缺血事件的发生率，预防发生术后再狭窄，改善患者的预后。

［1］Mega JL，Close SL，Wiviott SD，et al.Cytochrome P－450polymorphisms and response to clopidogrel［J］.N Engl J Med，2009，360（5）：354.

［2］Sibbing D，Stegherr J，Latz W，et al.Cytochrome P450 2C19loss of function poIymorphism and stent thrombosis following pereutaneous coronary intervention［J］.Eur Heart J，2009，30（8）：916.

［3］FDA Drug Safety Commuication：reduced efectiveness of Plavix（elopidogre1）in patients who are poor metabolizers of the drug.US Food and Drug Administration［EB／OL］.http：／／www.fda.gov／drugs／drugsafety／Postmarket Drug Safety lnformation for Patients and Providers／ucm203888.htm.Accessed October 24，2012.

［4］Baner T，Bouman HJ，van Werkum JW，et al.Impact of CYP2C19 variant genotypes on clinical efficacy of antiplatelet treatment withclopidogrel：systematic review and meta－analysis［J］.Br Med J，2011，343：d4588.doi：10.1136／bmj d4588.

［5］Fontana P，Senouf D，Mach F.Biological effect of increased maintenance dose of clopidogrel in cardiovascular outpatients and influence of the cytochrome P450 2C19＊2allele on clopidogrel redponsiveness［J］.Thromb Res，2008，121（4）：463.

［6］Gurbel PA，Bliden KP，Guyer K，et al.Platelet reactivity in patients and recurrent events post－stenting：results of the PREPARE POST－STENTING study［J］.J Am Coil Cardiol，2005，46（10）：1820.

［7］Vlachojannis GJ，Dimitropoulos G，Alexpoulos D.Clopidogrel resistance：crurent aspects and future directions［J］.HeHenie J Cardiol，2011，52：236.

［8］Kidd RS，Curry TB，Gallagher S，et al.Identification of a null allele of CYP2C19in an African－American exhibiting toxicity to phenytoin［J］.Pharmacogenetics，2001，11：803.

［9］Kim M，Kong E.Genetic polymorphisms of cytochrome P450 2C19in functional dyspeptic patients treated with cimetidine［J］.Korean J Physiol Pharmacol，2012，16：339.

［10］Park DK，Park HJ，Lee CY，et al.Nanogap－based electrical PNA chips for the detection of genetic polymorphism of cytochrome P450 2C19［J］.J Nanosci Nnotechnol，2012，12：5155.

Association between genetic polymorphisms of CYP2C19 and the clinical response to clopidogrel by fluorescence PCR

JIN Xin，CHEN Shui－ping，ZUO Xiang－hua，et al.（Department of Clinical Laboratory，the 307th Hospital of Chinese People’s Liberation Army，Beijing100071，China）

ObjectiveTo investigate the correlation the between genotypes of CYP2C19and treatment effect of clopidogrel by analyzing the relationship between CYP2C19and the ADP inhibition rates.MethodsThe EDTA anticoagulated venous blood of 55post PCI patients who were diagnosed with acute coronary syndromes were collected，genomic DNAs were extracted and amplified by real－time fluorescent PCR，and then the ADP inhibition rates were detected.The data were analyzed by atatistical software.ResultsAccording to the different genotypes，all the patients were divided into three groups.Among the 55patients，there were 49.09%（27／55）patients with extensive metabolizer group，38.19%（21／55）patients with intermediate metabolizer group，12.73%（7／55）patients with poor metabolizer group.There were significant differences among the ADP inhibition rates of extensive metabolizer group，intermediate metabolizer group and poor metabolizer group.ConclusionThere were association between CYP2C19gene polymorphisms and clopidogrel resistance.The anticoagulant effect of clopidogrel in the CYP2C19poor metabolism genotype patients was poor.

CYP2C19；clopidogrel；fluorescence PCR；ADP inhibitory rate

R541.4

：A

金欣（1978－），女，主治医师，医学硕士，研究方向：分子生物学；于农，主任技师，主要方向：分子生物学检验。

2014－07－11）

1007－4287（2014）12－1948－03

国家高技术发展计划（863计划）（2011AA02A109）

＊通讯作者