406例肺癌小活检标本中表皮生长因子受体基因的突变分析

陈 剑，张 燕，王 华，叶菊香，裴 斐，张 波

406例肺癌小活检标本中表皮生长因子受体基因的突变分析

陈 剑，张 燕，王 华＊，叶菊香，裴 斐，张 波

（北京大学医学部病理学系／北京大学第三医院病理科，北京100191）

目的探讨肺癌小活检标本中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的突变情况。方法采用蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions ARMS）检测406例肺癌小活检标本中EGFR基因第18、19、20和21外显子的突变情况。结果在406例肺癌小活检标本中，检测到190例存在EGFR突变（占46.8%），其中80例为第19外显子框内多核苷酸缺失、88例为第21外显子L858R突变、4例为第21外显子L861Q突变、9例为第18外显子G719X突变、2例为第20外显子S768I突变、1例为第20外显子T790M突变；此外，发现6例存在双位点突变。肺腺癌EGFR突变率为55.5%（186／335），鳞状细胞癌突变率为5.8%（3／52），5例腺鳞癌中有1例检测到EGFR基因突变，其它类型肺癌均未检测到EGFR基因突变（0／14）。女性患者EGFR基因突变率（62.4%）明显高于男性患者（32.1%，P＜0.01），非吸烟患者EGFR基因突变率（59.8%）明显高于吸烟患者（24.7%，P＜0.01）。结论EGFR基因突变多见于女性、非吸烟和肺腺癌患者；Scorpions ARMS是检测活检小标本EGFR基因突变的可靠方法。

肺肿瘤；表皮生长因子；受体；基因突变；小活检标本

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1944）

目前，肺癌的发病率和死亡率仍然高居榜首，分子靶向治疗开始成为部分肺癌患者重要的治疗手段［1］；其中，针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变而设计的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）已开始在临床应用［2］。及时为临床提供肿瘤组织EGFR基因突变状况以指导靶向治疗成为当前肺癌分子检测的重要任务［3］；但是约70－85%的新发肺癌是无法进行手术切除的晚期病例，这就意味着只能用穿刺组织或细胞学等小活检标本进行诊断或做进一步检测。对于肿瘤细胞较少的标本来说，需要选择灵敏度高、特异性强、简单快速的检测方法。我们运用蝎形探针扩增阻滞突变系统（scorpions amplification refractory muta－tion system，Scorpions ARMS）检测了406例肺癌患者穿刺组织、支气管镜活检组织以及胸水沉渣标本中EGFR基因突变情况，并对如何提高小活检标本基因检测的质量做了介绍。

1 材料与方法

1.1临床资料

收集北京大学第三医院2012年6月至2014年2月间确诊为原发性肺癌的小活检标本406例。其中CT引导下经皮肺穿刺353例、支气管镜活检26例、胸水沉渣标本13例、淋巴结穿刺组织5例、骨穿组织9例。男性209例，女性197例。年龄15岁至84岁，中位年龄63岁。组织学类型：腺癌335例、鳞状细胞癌52例、腺鳞癌5例、大细胞癌5例、小细胞癌3例、非小细胞肺癌（非特指类型）5例、类癌1例。所有标本均为治疗前获取，经4%中性甲醛固定、石蜡包埋。

1.2DNA抽提

从石蜡包埋组织中切取5－8μm厚切片10片置于1.5ml离心管中，切片时每例之间用75%酒精将切片刀消毒以防止交叉污染。所有标本均同时切一张HE染色切片，用于判断组织中肿瘤细胞含量。采用QIAamp DNA FFPE Tissue（QIAGEN公司）试剂盒提取组织DNA，操作步骤按说明书进行。提取的DNA经NANODROP超微量分光光度计测定浓度。

1.3ARMS法检测EGFR基因突变

采用QIAGEN公司的EGFR RGQ PCR检测试剂盒。按操作规程检测EGFR基因4个外显子中的29种突变；包括第18外显子中G719X的3种点突变，第19外显子中的19种缺失突变，第20外显子中T790M、S7681点突变以及3种插入突变，第21外显子中L858R、L861Q点突变。总反应体系为25μl，其中含探针缓冲液19.5μl、Taq酶0.5 μl、模板DNA 5μl。使用QIAGEN公司RGQ PCR仪进行检测。PCR反应条件如下：95℃预变性15 min；95℃变性30s、60℃退火1min，循环40次。每批反应均同时设置阳性和阴性对照。反应结束后，通过荧光信号曲线及阈值线来判读突变结果。

1.4统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。用χ2检验和Fisher精确概率检验比较不同组别EGFR基因突变情况的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ARMS法检测肺癌小活检标本中EGFR基因突变情况

406例肺癌小活检标本中，共检测到190例存在EGFR基因突变，突变率为46.8%；其中80例出现第19外显子框内多核苷酸缺失（占所有突变的42.1%，图1）、88例为第21外显子L858R突变（46.3%，图2）、4例为第21外显子L861Q突变（2.1%）、9例为第18外显子G719X突变（4.7%）、2例为第20外显子S768I突变（1.1%）、1例为第20外显子T790M突变。第19外显子与第21外显子单一突变占所有突变的90.5%，而第18外显子与第20外显子单一突变占所有突变的6.3%。此外，6例出现双位点突变，其中3例为第19外显子缺失和第20外显子T790M突变（图3）、3例为第18外显子G719X和第20外显子S768I突变。

图1 第19外显子框内缺失突变

图2 第21外显子点突变（L858R）

图3 第19外显子缺失和第20外显子T790M双位点突变

经皮肺穿刺组织353例，检测到166例存在EGFR突变，检出率为47%；支气管镜活检组织26例，检测到9例存在EGFR突变，检出率为34.6%；胸水沉渣组织13例，有8例出现EGFR突变，占61.5%；淋巴结穿刺组织5例，其中2例检出EGFR突变（40%）；骨穿组织9例，有5例检出EGFR突变（55.6%）。

2.2EGFR基因突变与肺癌临床病理指标之间的相关性（表1）

本组病例EGFR基因突变检测结果显示女性患者EGFR基因突变率为62.4%（123／197），明显高于男性患者（32.1%，67／209）；非吸烟患者EGFR基因突变率（59.8%，153／256）明显高于吸烟患者（24.7%，37／150），差异具有统计学意义。组织学类型中，335例肺腺癌中检测到EGFR突变的有186例、占55.5%，52例鳞状细胞癌中EGFR突变者3例、占5.8%，5例腺鳞癌中有1例检测到EGFR基因突变，其它类型肺癌均未检测到EGFR基因突变（0／14）。腺癌患者EGFR基因突变率明显高于单纯鳞状细胞癌和其它类型肺癌（P＜0.01）。EGFR基因突变与患者年龄无明显相关性。

表1 EGFR基因突变情况与临床病理特点的关系［例数（%）］

3 讨论

肺癌的分子靶向治疗已逐渐为大家所熟知；小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）对于有EGFR基因突变的肺癌患者具有较高的客观缓解率和生存质量［4］。因此，国内外有关临床指南的诊治中已明确指出，部分非小细胞肺癌（NSCLC）患者在作出诊断时就应进行EGFR基因突变检测［5，6］。

人EGFR基因位于第7号染色体p13－q22区，全长200kb，由28个外显子组成；编码1186个氨基酸，糖蛋白分子量约170kDa。EGFR是一种重要的跨膜受体，具有酪氨酸激酶（TK）活性。人类许多恶性肿瘤如NSCLC、结直肠癌、头颈部肿瘤、胰腺癌、乳腺癌等都存在EGFR的突变或异常表达，所引起的信号传导失控与这些肿瘤的发生、发展密切相关。研究表明：EGFR突变与肺癌病理类型有关，在腺癌患者中突变发生率相对较高；最常见的是EGFR第19外显子缺失和第21外显子点突变（约占85%－90%），第18、20外显子突变率约占10%［7，8］。EGFR基因突变的NSCLC患者，应用小分子酪氨酸激酶抑制剂（Gefitini－吉非替尼，Erlotinib－厄洛替尼）治疗的有效率可达70%－80%。因此，对于NSCLC标本进行EGFR基因检测能够很好地指导临床靶向治疗［9］。

CT引导下经皮肺穿刺或支气管镜活检等技术，由于微创、操作简便、并发症少等优势，已越来越广泛应用于临床。多数晚期NSCLC患者难以进行手术治疗，肺穿刺活检是明确诊断的一个重要手段。因此，能够用于分子检测的标本多为小活检标本。与手术切除标本相比，小活检标本中所含肿瘤细胞比例较低，肿瘤细胞分布较分散，难以人工富集细胞。在小活检标本中检测基因突变，需要采用更为灵敏精准的方法。相关研究显示，传统的直接测序法灵敏度有限，肿瘤组织的突变含量需要达到20%以上才能被检出［10］，而以实时荧光定量PCR法为基础的扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）则具有较高的敏感性和特异性［11］。

蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions ARMS）是将ARMS和Scorpions PCR两种技术结合起来的一种新技术［12］。Scorpions探针由一条发夹结构的探针和一条引物构成，探针的5′端和3′端分别标记报告荧光和淬灭荧光，扩增过程中发夹结构打开，两种荧光信号分离，即可检测到报告荧光信号。由于序列特异性引物和探针在同一分子上，因此信号产生较快，可以检测出样品中含量低至1%的突变基因，具有灵敏度高、特异性强的特点，并且操作流程简单、快速，整个过程无需反复开盖，也无产物的后续处理，可以最大程度地避免扩增产物之间的交叉污染和环境污染。样品在检测的同时还设置了阳性及阴性对照，有效地避免了假阳性和假阴性，保证了结果判断的准确性和可靠性，尤其适用于穿刺、细胞学等肿瘤细胞较少的标本。

研究表明，女性、非吸烟、腺癌及亚洲人群肺癌患者EGFR的突变率较高［13－15］。我们运用Scorpions ARMS检测了406例原发性肺癌患者小活检标本中EGFR基因突变情况，共检测到190例中存在EGFR突变，检出率为46.8%；其中90%以上突变发生在第19和21外显子。本组研究还发现了6例双位点突变，其中3例为第19外显子缺失和第20外显子T790M突变，后者是导致肿瘤对吉非替尼继发耐药的原因之一。本组病例检测结果也显示女性患者的EGFR基因突变率高于男性患者；非吸烟患者的EGFR基因突变率为59.8%，高于吸烟患者（24.7%）；肺腺癌EGFR突变率为55.5%，明显高于鳞状细胞癌（5.8%）；其它类型肺癌中未检测到EGFR基因突变。说明ARMS法检测活检小标本EGFR基因突变具有特异性强、灵敏度高等优点，对于临床部分肺癌的分子靶向治疗具有重要指导作用。

由于小活检标本体积小、组织疏松、质软易碎，处理不当易使组织收缩、变脆、影响后续观察和检测；因此，我们对小活检标本固定、脱水、浸蜡等过程的时间及所用试剂的浓度进行了严格控制。主要控制措施是：①选用4%中性缓冲甲醛固定，固定时间短于2小时；②逐级常温脱水，在无水乙醇中停置时间不能过长，否则组织变硬变脆；③浸蜡包埋时温度不可过高。小活检标本除常规制备HE切片外，还须进行免疫组化染色，能够用于基因检测的组织较少。我们采用了预留免疫组化和基因检测切片（或蜡卷）的方法，即做HE切片时，对于临床怀疑肺癌的小活检标本，我们一并切出6－8张免疫组化白片和8－10张蜡卷作为分子检测备用；这样可以避免二次切片时，因修块而导致组织过少；同时将最后一张白片再染一张HE切片，以评估肿瘤细胞的含量和比例，使DNA提取的成功率明显提高。

［1］Mok TS，Wu YL，Thongprasert S，et al.Gefitinib or carboplatinpaclitaxel in pulmonary adenocarcinoma［J］.N Engl J Med，2009，361（10）：947.

［2］Maemondo M，Inoue A，Kobayashi K，et al.Gefitinib or chemotherapy for non－small－cell lung cancer with mutated EGFR［J］.N Engl J Med，2010，362（25）：2380.

［3］Rosell R，Carcereny E，Gervais R，et al.Erlotinib versus standard chemotherapy as first－line treatment for European patients with advanced EGFR mutation－positive non－small－cell lung cancer（EURTAC）：a multicentre，open－label，randomised phase 3trial［J］.Lancet Oncol，2012，13（3）：239.

［4］Zhou C，Wu YL，Chen G，et al.Erlotinib versus chemotherapy as first－line treatment for patients with advanced EGFR mutationpositive non－small－cell lung cancer（OPTIMAL，CTONG－0802）：a multicentre，open－label，randomised，phase 3study［J］.Lancet Oncol，2011，12（8）：735.

［5］中国表皮生长因子受体基因突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南（2013版）［J］.中华肿瘤杂志，2013，35（6）：478.

［6］Dillon B，Naidoo B，Knight H，et al.NICE guidance on erlotinib for first－line treatment of EGFR－TK mutation－positive advanced or metastatic non－small－cell lung cancer［J］.Lancet Oncol，2012，13（8）：764.

［7］Rosell R，Moran T，Queralt C，et al.Screening for epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer［J］.N Engl J Med，2009，361（10）：958.

［8］Sharma SV，Bell DW，Settleman J，et al.Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer［J］.Nat Rev Cancer，2007，7（3）：169.

［9］Mitsudomi T，Morita S，Yatabe Y，et al.Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non－small－cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor（WJTOG3405）：an open label，randomised phase 3trial［J］.Lancet Oncol，2010，11（2）：121.

［10］Pao W，Ladanyi M.Epidermal growth factor receptor mutation testing in lung cancer：searching for the ideal method［J］.Clin Cancer Res，2007，13（17）：4954.

［11］Thelwell N，Millington S，Solinas A，et al.Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（19）：3752.

［12］Cushman－Vokoun AM，Crowley AM，Rapp SA，et al.Comparison study of the performance of the QIAGEN EGFR RGQ and EGFR pyro assays for mutation analysis in non－small cell lung cancer［J］.Am J Clin Pathol，2013，140（1）：7.

［13］Qin BM，Chen X，Zhu JD，et al.Identification of EGFR kinase domain mutations among lung cancer patients in China：implication for targeted cancer therapy［J］.Cell Res，2005，15（3）：212.

［14］Mu XL，Li LY，Zhang XT，et al.Gefitinib－sensitive mutations of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domain in Chinese patients with non－small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res2005，11（12）：4289.

［15］Fukuoka M，Wu YL，Thongprasert S，et al.Biomarker analyses and final overall survival results from a phase III，randomized，open－label，first－line study of gefitinib versus carboplatin／paclitaxel in clinically selected patients with advanced non－small－cell lung cancer in Asia（IPASS）［J］.J Clin Oncol，2011，29（21）：2866.

Analysis of epidermal growth factor receptor gene mutations in 406 small biopsy samples of lung cancer

CHEN Jian，ZHANG Yan，WANG Hua，et al.
（Department of Pathology，Peking University Health Science Center／Peking University Third Hospital，Beijing100191，China）

ObjectiveTo investigate the mutations of epidermal growth factor receptor（EGFR）gene in small biopsy samples of lung cancer.MethodsMutations of EGFR gene（exons18，19，20and 21）in small biopsy specimens from 406cases of lung cancer were detected by scorpions amplification refractory mutation system（Scorpions ARMS）.ResultsEGFR gene mutations were identified in 190of 406（46.8%）small biopsy samples of lung cancer.In－frame deletions of exon 19occurred in 80patients and point mutation occurred at codon 858，861（exon 21）in 88and 4patients respectively.Nine patients had mutation at codon 719x（exon18）.Two patients had point mutation occurring at codon 768（exon 20）and one patient had point mutation occurring at codon 790（exon 20）.In addition，six patients had compound mutations.Mutations were present in 55.5%of 335adenocarcinoma and in 5.8%of 52squamous carcinoma.EGFR mutation was found in 1of 5adenosquamous carcinoma.There were no EGFR mutation in other type of lung cancer（0／14）.EGFR mutation rate was higher in female patients and patients without smoking history than male patients and patients with smoking history（P＜0.01，respectively）.ConclusionEGFR mutations were more common in female，nonsmoking patients with adenocarcinoma histology.Scorpions ARMS assay is a reliable，specifical and sensitive method for the detection of EGFR kinase domain mutations in small biopsy samples.

lung neoplasms；epidermal growth factor；receptor；gene mutation；small biopsy samples

R734.2

：A

2014－05－20）

1007－4287（2014）12－1944－04

国家自然科学基金项目（81272945）

＊通讯作者