乳杆菌H D 1.7肽类代谢产物的分离检测

陈兵，原韬，黄微薇，王艳梅

（1.黑龙江工业学院环境工程系，黑龙江鸡西158100；2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150001；3.黑龙江省科学院高技术研究所，黑龙江哈尔滨150001）

乳酸菌是一类将可发酵性糖转化成乳酸的厌氧菌。日常生活中，人们经常腌制酸菜这种发酵性食品，主要就是依靠乳酸菌厌氧发酵的原理。在发酵基质酸菜水中含有多种乳酸菌的代谢产物，主要为肽类、多糖等。其中肽类物质经证实与Nisin[1]类似，具有一定的抑菌活性。

本课题研究结合梯度盐析[2-3]的方法，通过减压浓缩[4]、透析层析的技术手段从乳酸杆菌HD1.7[5]的酸菜水[6]中提纯了这种肽类物质[7]，并深入研究其抑菌能力，与Nisin进行对照，同时检测出其确切分子量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

测试菌：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，江苏绿科生物技术有限公司；酸菜水，鸡西丰源食品有限公司L-乳酸酸菜发酵液；胰蛋白酶 [0.15%（g/mL）]：美国GIBCO 公司；Marker（2 ku～36 ku）：纽英伦（NEB）生物技术有限公司；Nisin（1×106IU/g）：美国 Sigma公司。

测试菌培养基：准确称取酵母膏3 g，蛋白胨8 g，蔗糖5 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钠2 g，琼脂10 g，加水至 1 000 mL，调节 pH6.8～7.0。

图1 酸菜发酵液中肽类代谢产物的提取工艺Fig.1 Extraction technology of peptide metabolites from sauerkraut fermentation juice

ELITE 300垂直板电泳仪：美国WEALTEC公司；YC-3000喷雾冷冻干燥机：上海雅程仪器设备有限公司；Rotavapor R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司。

1.2 工艺流程

1.3 实验设计

1.3.1 发酵液浓缩条件选择

量取300 mL酸菜发酵液，在室温下用离心机3 000 r/min～4 000 r/min离心处理30 min，弃除下层杂质和菌体泥状混合物，保留上层清液，测量记录上清液体积。然后用抽真空水浴式旋转蒸发仪在系列温度梯度下抽真空减压式浓缩1 h，得到相应条件浓缩液。

温度梯度：25、30、35、40、45、50、55 ℃。

将上述温度梯度浓缩所得的浓缩液，分别稀释至浓缩前上清液体积值，进行滤纸片抑菌试验[8-9]，同时和浓缩前上清液进行对比，测定抑菌圈直径。

以浓缩液黏稠性、抑菌能力为评价标准，选择最佳浓缩条件。

1.3.2 浓缩液盐析条件选择

向上述抑菌效果较好的酸菜浓缩液中加入一定浓度的（NH4）2SO4溶液并搅拌，注意沉淀量的大小。首先选取质量浓度较低的（NH4）2SO4溶液进行盐析[10]，观察有无沉淀出现，逐渐增大（NH4）2SO4溶液质量浓度，观察沉淀有无。

若有沉淀出现，将该浓度的（NH4）2SO4盐析后的溶液搅拌均匀，分装离心管进行离心，温度4℃，转速20 000 r/min，离心处理20 min。离心后取出离心管，以上清液和沉淀为测试物，用同浓度（NH4）2SO4做空白进行抑菌试验，观察抑菌圈大小。

混合上述离心管中的上清液，继续增大（NH4）2SO4溶液质量浓度进行盐析，当沉淀再次出现时，按照上述离心操作并进行抑菌试验。

依此类推，直至不再出现沉淀为止。

盐析浓度梯度：15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%。

以盐析沉淀量多少、抑菌效果为评价标准，选择最佳盐析条件。

1.3.3 透析除硫酸铵盐条件

已知Nisin的分子量为3 510 u，以透析袋的截留分子量乘以2＜目的蛋白分子量的原则为标准选择透析袋进行透析除盐[11]。收集梯度盐析沉淀，加入0.01 mol/L Tris-H3PO4直至沉淀完全溶解，装入透析袋截留分子量为1 500 u的透析袋在4℃下透析18 h～24 h，透析外液使用蒸馏水，5 h～6 h更换一次透析外液，直至向外液中滴入BaCl2溶液，不生成BaSO4为止。保留透析袋内物质进行层析分离试验。

1.3.4 透析物分离纯化

将100 g Sephadex G-25干胶颗粒悬浮于3倍量的蒸馏水中充分溶胀，进行凝胶活化[12]。活化好后装Sephadex G-25柱。采用HAc-NaAc缓冲溶液平衡层析柱，平衡后上样分离，流速控制为1.0 mL/min，上样量为5 mL，层析缓冲液使用pH=3.6的HAc-NaAc溶液30 mL，用0.02 mol/LKCl溶液90 mL作为洗脱液进行洗脱[12]。按1 mL/管定时接收，并数字标记层析接收管，试验共标记96个接收管，在紫外280nm下进行吸光度值测定[13]。根据层析接收物质吸光值的不同，绘制层析接收液吸光值曲线，选择吸光值较高部分进行收集。

1.3.5 分离纯化液干燥条件

混合A280值较大的层析管内溶液，采用YC-3000喷雾冷冻干燥机在-15℃下进行喷雾干燥[14]，制备干粉样品。

1.3.6 干粉性质测定

干粉对比Nisin进行抑菌能力测定。称取10 mg干粉和10 mg Nisin，分别用0.01 mol/LTris-H3PO4溶解，并用蒸馏水稀释至1 mg/mL。用0.01 mol/L Tris-H3PO4做空白进行滤纸片抑菌试验，对比抑菌圈大小。

干粉具备蛋白质性质检测。将10mg干粉用0.01mol/L Tris-H3PO4溶解，并用蒸馏水稀释至1 mg/mL，用0.5%NaOH溶液调节pH至中性，加入1.5 mg/mL胰蛋白酶消化，并保温1 h后，沸水浴3 min使胰蛋白酶灭活，然后进行抑菌试验，用pH调至中性的干粉溶解液做空白。

干粉分子量大小测定。采用聚丙烯酰胺垂直板电泳[15]分析干粉的分子量大小，电泳点样测试物为Nisin，干粉样品3份（干粉1、2、3）及Marker。电泳后用蒸馏水冲洗胶片，将胶片浸入考马斯亮蓝R-250染色液，染色2 h～3 h，再用蒸馏水冲洗胶片，然后浸入脱色液脱色1次～2次，每次30 min。观察脱色胶片上各谱带位置，参照Marker确定样品分子量。

2 结果与分析

2.1 发酵液最佳浓缩条件确定

原始300 mL酸菜发酵液离心处理后的上清液体积为248 mL。将发酵液温度梯度浓缩，得到相应条件的浓缩液七种，样品性状见表1。

表1 不同温度下浓缩液状态比较Table 1 The comparison of oncentrated liquid state in different temperature

将25℃条件下的浓缩液稀释后的样品编号为1，30℃条件下的浓缩液稀释后的样品编号为2，以此类推，得到不同温度下的浓缩液稀释后的抑菌效果见表2。

表2 稀释液抑菌直径比较Table 2 The comparison of diluted liquid antibacterial diameter

通过表1和表2可以看出，酸菜发酵液可选择利用在40℃条件下，浓缩比例为300 mL∶60 mL=5∶1，粘稠度适中的浓缩液，利于盐析。同时在此温度下浓缩，浓缩液的抑菌能力对比浓缩温度为0℃的原始离心上清液也很明显，而在相同浓缩时间条件下，其它温度的浓缩液抑菌效果相对不理想。

2.2 盐析条件选择

酸菜水最佳条件浓缩液浓度梯度盐析结果见表3。

表3 浓度梯度盐析沉淀量对比Table 3 The comparison of concentration gradient salting precipitation

通过表3可知，向酸菜浓缩液中加入25%（NH4）2SO4溶液后出现沉淀，离心后测定上清液和沉淀的抑菌效果。混合25%（NH4）2SO4溶液盐析后的离心上清液，增大盐析浓度到50%时，沉淀再次出现，离心后上清液和沉淀的抑菌效果见表4。

表4 抑菌圈直径测定结果Table 4 The results of determination of bacteriostatic band diameter

表3和表4结果表明，25%（NH4）2SO4盐析上清液抑菌直径明显大于50%（NH4）2SO4盐析上清液抑菌直径，说明25%（NH4）2SO4盐析后的清液中还存在没有被沉淀下来的抑菌物质，需增大盐浓度继续盐析。50%（NH4）2SO4盐析沉淀抑菌直径明显大于 25%（NH4）2SO4盐析沉淀抑菌直径。说明用 50%（NH4）2SO4进行盐析后，得到了存在于25%（NH4）2SO4盐析上清液中的有效抑菌成分。50%（NH4）2SO4盐析上清液抑菌直径略大于此时空白试验的抑菌直径，说明经50%（NH4）2SO4盐析后，上清液中绝大部分的抑菌成分已经被沉淀出来，很少部分的抑菌成分还保留在清液中，根据盐析浓度，推测该少部分的抑菌物质可能是乳酸菌的次级代谢产物胞外多糖[16-17]，抑菌能力较弱。

2.3 透析物分离纯化

收集25%和50%（NH4）2SO4梯度盐析后的离心沉淀，经过透析层析后，在280 nm下，用紫外可见分光光度计分别测定1～96号接收管内液体的吸光值，并绘制吸光值曲线，结果见图2。

图2 层析接收液吸光值曲线Fig.2 The curve of chromatography for receiving fluid absorption value

数据显示出现两个峰值波动，第一次峰值附近（28～35号管），认为是酸菜水中的大分子抑菌成分，属于快速洗脱组分，予以收集，其中31号管出现最大吸光值，A280=0.195。第二次峰值附近（62～82号管），认为是酸菜水中小分子抑菌成分，含量较多，属于较慢洗脱组分，予以收集，其中70号管出现最大吸光值，A280=0.316。选择收集28～35、62～82号层析管内液体组分，进行冷冻喷雾干燥处理制备冻干粉。

2.4 干粉性质测定

冷冻喷雾干燥所得干粉的抑菌能力测定结果见表5。干粉具备蛋白质性质检测结果见表6。

表5 相同浓度下物质抑菌直径比较Table 5 The comparison of bacteriostatic band diameter in same concentration

表6 胰蛋白酶处理前后中性干粉液抑菌直径比较Table 6 The bacteriostatic diameter comparison of neutral powder liquid with trypsin added before and after

表6结果表明，pH调至中性的干粉液有明显的抑菌效果，抑菌圈直径d=1.52 cm。用胰蛋白酶处理后，抑菌圈直径d=0 cm，干粉液抑菌活性消失，即该干粉抑菌物质可被蛋白酶分解，说明该物质具备蛋白质性质。

电泳胶片经脱色后可清晰看见Nisin、样品干粉、Marker谱带，具体结果见图3。

图3电泳照片表明Nisin分子量为3510 Da左右，干粉样品分子量为3.5 ku和22 ku左右。显示两个分子量的值与吸光值测定试验得到的两个峰值的结果相吻合。

图3 电泳胶片谱带照片Fig.3 The photo of electrophoresis gel-film

3 结论

通过设计实验从酸菜水中分离纯化了乳酸杆菌HD1.7的肽类代谢产物。主要研究确定了原料在40℃下抽真空减压浓缩5倍为最佳浓缩条件，在25%和50%两个（NH4）2SO4盐析浓度下可得到抑菌效果较好的有效成分。原料制备干粉后经抑菌检测显示其具备较强的抑菌能力，经胰蛋白酶检测证实其可被蛋白酶分解，具有蛋白质性质，同时电泳试验确定了其具体分子量组成，主要包括3.5 ku和22 ku两部分，这与实验在280 nm下测得的含有效成分层析液的A280=0.195和A280=0.316两个吸光峰值相吻合。由于分子量较小，说明提纯物质是小分子肽类。如果在盐析层面上使用更高浓度的（NH4）2SO4进行，可能会得到新的沉淀，进而有可能更加标准化的确定该物质的分子量组成。实验研究为乳酸菌肽类代谢产物继续深入化研究提供了可靠的依据，相信随着食品工业的发展，这种小肽类防腐剂将会具有更广阔的应用前景，也必将创造出更大的效益。

[1] 宁喜斌.乳酸菌素的特性及应用[J].上海水产大学学报,2002,11(3):289-294

[2] 孔祥智,黄雪松.硫酸铵盐析法分步分离大蒜SOD和蒜氨酸酶的研究[J].食品工业科技,2008,29(1):165-166

[3] 蔡春尔,何培民.硫酸铵三步盐析对藻胆蛋白纯化的影响[J].生物技术通报,2006(4):121-125

[4] 王世宽,冉燃,潘明,等.减压处理对泡菜乳酸菌及风味物质的影响[J].工业微生物,2010,40(2):46-48

[5] 雷虹,齐桂云,李秀凉,等.乳酸杆菌小分子抗菌肽产生菌的筛选及鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(7):671

[6] 葛菁萍,邹鹏,宋刚,等.酸菜发酵液中乳酸菌的分离与鉴定[J].食品工业科技,2007,28(10):83-84

[7] 杜晓宁,宋明鸣.多肽类物质分析检测方法的研究进展[J].上海化工,2009,34(11):6-9

[8] 张少飞,李敏,邢志国,等.产抑菌物质SDLH菌株的鉴定及发酵产物稳定性研究[J].生物技术，2009,19(5):56-59

[9] 李敏,张少飞,刑志国，等.中华稻蝗内生菌SDLH抑菌物质发酵条件优化[J].生物技术，2008,18(6):78-81

[10]朱丽萍,颜世敢,李雁冰，等.硫酸铵盐析条件对多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白得率和纯度的影响[J].科技导报，2010,28(4):37-41

[11]马赛箭,安超.乳链菌肽的发酵及分离纯化工艺研究进展[J].保鲜与加工,2011,11(2):45-48

[12]杨歌德,姜玉梅,周宏博.凝胶过滤层析分离蛋白质实验中三种过滤介质分离效果的比较[J].上海水产大学学报,2002,36(3):242-243

[13]李巧玲,刘景艳.紫外-可见分光光度法在食品分析中的应用[J].中国食品添加剂,2005(5):113-116

[14]黄群,麻成金,周姣,等.干燥方法及理化因素对鹌鹑蛋白粉功能特性的影响[J].食品科学,2008,29(10):299-302

[15]何荣海,马海乐,肖海芳.条斑紫菜油脂与蛋白质组成分析[J].食品与机械,2007,23(6):76-78

[16]梅秀明,潘道东.乳酸菌发酵液中胞外多糖的超滤浓缩技术研究[J].食品科学,2008,29(12):413-416

[17]张天琪,张雪,孔保华,等.东北酸菜中产胞外多糖乳杆菌的分离筛选及其在酸乳中的应用[J].中国乳品工业,2009,37(7):8-12