银杏叶中黄酮类物质的酶法提取研究

张伟，张焕新，施帅

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300）

银杏叶，形似扇，又像飞蛾或鸭脚形，江苏泰州是我国银杏四大主要产区之一，素有“银杏之乡”的美誉，栽植银杏近800万株，占全国的三分之一。银杏叶中含有160多种化学成分，其中黄酮类化合物、萜类内酯被认为是主要活性成分，银杏酚酸为主要毒性成分[1]，黄酮类化合物具有极强的清除自由基能力和抗氧化能力，具有良好的防治心血管疾病的功效，因而受到国内外的广泛研究[2-3]。银杏叶中黄酮类物质主要包裹在细胞壁内（由β-D-葡糖以1，4-β-葡糖苷键连接），传统方法大多不能完全破碎细胞壁，限制了黄酮类物质的溶出，严重影响了提取效率[4]。纤维素酶是一类复合酶，它能将组成细胞壁的纤维素骨架逐级降解成葡萄糖，进而破坏细胞壁骨架结构，增加细胞内活性成分的溶出[5]。因此，本文拟探索纤维素酶法提取银杏叶总黄酮的最佳工艺，以期提高提取得率，并进一步探索银杏叶提取物中黄酮类物质的种类。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

银杏叶：大佛指品系，采自江苏畜牧兽医职业技术学院校内；HCl、乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、NaOH、H3PO4、氯化铁、磷酸、高硫酸钾均为分析纯：中国医药集团上海化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：中国医药集团上海化学试剂有限公司；芦丁标准品、槲皮素对照品、山奈酚对照品、异鼠李素对照品：中国药品生物制品检验所；纤维素酶（酶活35 000 IU/g）：Sigma中国。

1.1.2 主要仪器设备

JH722可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；Fw 177型中草药粉碎机：上海隆拓仪器设备有限公司；RE-52D旋转蒸发器：上海青浦沪西仪器厂；Empower色谱工作站、Sunfire C18反相柱（4.6×150 mm，2.5 μm）、1525 μ 型二元泵、2996 紫外光检测器：美国Waters公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取工艺

新鲜银杏叶经过低温烘干后，用中草药粉碎机粉碎后过60目筛，准确称取2.0 g，酶水解后灭酶，加入乙醇溶液浸提24 h，冷藏后过滤，计算银杏叶总黄酮提取得率。

1.2.2 酶解工艺

以酶解温度、酶处理pH、酶浓度和酶解时间为4个考察因素，以银杏叶总黄酮提取得率为考察指标，进行L9（34）正交试验设计，考察各因素对银杏叶总黄酮提取得率的影响，以确定酶处理的最佳条件。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Parameters and test levels for orthogonal experiment

1.2.3 银杏叶中黄酮类物质的测定方法

以芦丁为标样，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法[6-7]测定银杏叶中黄酮类物质含量。标准曲线的回归方程为：A=11.679C-0.00128，式中：C为芦丁浓度，（mg/mL）；A为吸光度，相关系数R2=0.997 4，在浓度为0 mg/mL～0.056 mg/mL范围内，有良好的线性关系。

式中：C为由标准曲线计算得出的样品的总黄酮浓度，（mg/mL）；V为样品溶液的体积，mL；N为样品的稀释倍数；M为银杏干叶质量，mg。

1.2.4 银杏叶提取物中黄酮种类的鉴定

移取银杏叶提取物1 mL至50 mL的圆底烧瓶中，加入5 mL 25%的HCl溶液，在90℃水浴中回流加热30 min。迅速冷却，用甲醇定容至50 mL。用0.45 μm的微孔滤膜过滤。

色谱条件：选用反相柱进行洗脱。分析采用美国Waters公司1525μ型二元泵和2996型二极管阵列检测器和Empower色谱工作站。

色谱柱为Waters公司的sunfire C18反相柱（4.6×150mm，2.5μm）。流动相为A∶B=50∶50（体积比，A为100%的甲醇，B为0.4%H3PO4水溶液），流速为1.0 mL/min，进样量为 10 μL。

在线进行紫外检测，200 nm～400 nm全扫描，分辨率1.2 nm。检测波长为360 nm。

2 结果与讨论

2.1 酶解工艺条件的确定

2.1.1 酶解温度对银杏叶总黄酮提取得率的影响

准确称取2 g粉碎过筛的银杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc缓冲溶液，调节pH为4，酶浓度为 0.3 mg/mL，调节酶解温度为 30、35、40、45、50、55、60℃，酶解 2 h后灭酶，70%乙醇定容、提取、过滤，计算银杏叶总黄酮提取得率，结果见图1。

图1 酶解温度对总黄酮提取得率的影响Fig.1 Effect of temperature on flavonoids extraction yield

由图1可知，随着温度的升高，银杏叶总黄酮提取得率增大，在45℃时达到最大值，50℃保持在相似水平略有下降，随后，随着温度升高，总黄酮提取得率显著下降，当温度达到55℃后，总黄酮提取得率随温度变化下降不明显。这是由于纤维素酶在45℃～50℃之间有最大活力，同时也能保持较好的稳定性，如温度进一步加大，由于蛋白质变性，酶的活性降低，浸提效果反而变差。

2.1.2 酶处理pH对银杏叶总黄酮提取得率的影响

溶液的pH影响着酶的活性，纤维素酶的活性中心偏酸性条件[8]。故准确称取2 g粉碎过筛的银杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc缓冲溶液，调节酶解温度为45℃，酶浓度为0.3 mg/mL，酶解2 h后灭酶，70%乙醇定容、提取、过滤，考察pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 时，银杏叶总黄酮提取得率的变化，结果见图2。

图2 pH对总黄酮提取得率的影响Fig.2 Effect of pH on flavonoids extraction yield

由图2可知，当pH 4.5时，总黄酮提取得率最高，且呈现向两边递减的趋势。由于pH既能影响酶的构象，也会影响底物的解离状态，当pH4.5时，纤维素酶活力最大，可最大限度的破坏细胞壁纤维素β-1，4葡萄糖苷键，使传质阻力减小，从而浸提效率最高[9]。

2.1.3 酶浓度对银杏叶总黄酮提取得率的影响

准确称取2 g粉碎过筛的银杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc缓冲溶液，分别调节酶解温度为45℃，酶解pH为4，调整酶浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mg/mL，酶解 2 h 后灭酶，70%乙醇定容、提取、过滤，分别计算银杏叶总黄酮提取得率，结果见图3。

图3 酶浓度对总黄酮提取得率的影响Fig.3 Effect of enzyme consumption on flavonoids extraction yield

由图3可知，酶浓度增大，总黄酮提取得率提高。但当酶浓度增大到0.25 mg/mL时，总黄酮提取得率几乎不再提高，保持在相似水平并略有波动。

2.1.4 酶解时间对银杏叶总黄酮提取得率的影响

准确称取2 g粉碎过筛的银杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc缓冲溶液，调整pH为4、酶浓度为0.3 mg/mL，保持温度为45℃，分别酶解0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 后灭酶，70%乙醇定容、提取、过滤，计算银杏叶总黄酮提取得率，结果见图4。

由图4可知，随着酶解时间的延长，银杏叶总黄酮提取得率显著增大，但当酶解时间达到2 h后，银杏叶总黄酮提取得率增加不明显，因为酶解产物的浓度增加，抑制了水解过程。

图4 酶解时间对总黄酮提取得率的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on flavonoids extraction yield

2.1.5 正交优化试验结果与分析

在单因素实验的基础上，利用正交法“均衡分散”的特点[10]，以酶解温度、酶处理pH、酶浓度、酶解时间为考察因素，以银杏叶总黄酮提取得率为考察指标，进行正交设计，试验结果见表2。

表2 L9（34）正交试验结果Table 2Result of L9（34）orthgonal test

由表2可知，各因素对银杏叶总黄酮提取得率的影响依次是：酶解温度＞酶浓度＞酶解时间＞酶处理pH。

采用SPSS 13.0 for windows对正交试验结果进行方差分析，结果见表3。

由表 3 可知，酶解温度（p＜0.01）、酶浓度（p＜0.05）、酶解时间（p＜0.05）对银杏叶总黄酮提取得率有显著影响。酶处理pH对银杏叶总黄酮提取得率影响很小，作为误差项。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

根据银杏叶总黄酮提取得率高的要求，本实验确定最佳酶解条件为A2B1C3D2，即在酶解温度为45℃、酶处理pH为4、酶浓度为0.3 mg/mL、酶解时间2 h时，银杏叶总黄酮得率最高。根据最佳酶解条件，做3组验证性试验，同时做3组为未添加纤维素酶的空白试验，结果见表4。

表4 酶法提取与空白试验提取率比较Table 4 Comparison of extraction yield by cellulase and noncellulase

由表4可知，未添加纤维素酶的空白对照试验，黄酮类物质提取平均得率为1.92%，而酶法提取试验，黄酮类物质平均得率为2.80%，显著提高了45.83%。对比试验表明：纤维素酶在银杏叶总黄酮提取过程中发挥了重要作用，随着酶解进程的推进，纤维素酶不断地将银杏叶细胞壁裂解，促使包藏在细胞壁中的总黄酮不断释放出来，提高了总黄酮提取效率[11]。

2.2 银杏叶提取物中黄酮种类的鉴定

银杏叶提取物中黄酮类物质的HPLC检测结果见图5。

由图5可以知，银杏叶提取物中黄酮苷的3个峰与槲皮素，山奈酚，异鼠李素3个峰出峰时间一致，可以判断为银杏叶提取物中黄酮类物质成分主要是槲皮素，山奈酚，异鼠李素及其相对应的衍生物。

图5 黄酮的高效液相分析图谱Fig.5 The HPLC chromatogram of the flavonoid

3 结论

1）采用纤维素酶水解破壁，通过单因素试验和正交试验确定了纤维素酶水解破壁的最佳工艺为：酶解温度为45℃、酶处理pH为4、酶用量为0.3 mg/mL、酶解时间为2 h时，在此条件下，银杏叶总黄酮提取得率为2.80%，比空白对照组显著提高了45.83%。

2）通过比较银杏叶提取物和黄酮苷元对照品的高效液相图谱得出，银杏叶提取物中黄酮类物质主要是槲皮素、山奈酚和异鼠李素。

3）银杏叶粗提物中除了含有黄酮类物质之外，还含有大量的银杏内酯、银杏多糖、优质蛋白质等活性物质，可进一步探索银杏叶提取残渣内银杏内酯、银杏多糖和蛋白质的提取利用，以增加银杏叶的综合利用度。

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