高效酒精酵母菌的选育及鉴定

李忠英，陈杰山，罗跃中，吴永尧

（1.湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

随着全球石油能源的日趋枯竭及环境污染的加剧，开发新的绿色能源势在必行。燃料酒精替代汽油能源将逐渐成为发展趋势[1-2]。目前，采用燃料酒精生产多采用微生物发酵方式。生产酒精的菌种主要以酵母菌为主，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和品质。在酒精发酵时，产生的高浓度酒精和相对较高的发酵温度对产酒率影响较大，高浓度酒精会限制酵母菌的生长繁殖，对酒精发酵产生强烈的抑制作用；而耐高温酵母能减少生产中由于降温所带来的麻烦和费用。因此，高产酒精酵母的选育和发酵工艺的改进是实现酒精浓醪发酵工业化生产的关键[3]。我国也一直将选育优良的酒精酵母菌种和酒精发酵新工艺研究列为重点研究课题。

本项研究从自然界中筛选分离出具有较强温度和酒精耐受性的酵母菌TJ-18并对其进行初步鉴定，旨在筛选培育适用于酒精工业发酵的新菌种。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌样来源

各种腐败水果、葡萄园里土壤、湘天桥菜市场甜酒醪、湘乡燕京啤酒厂酒醪、学生食堂下污水及实验室教学用酵母菌等。

1.1.2 主要培养基

1.1.2.1 富集培养基（L）

含10%酒精麦芽汁（8°Brix）、含14%的酒精麦芽汁（10°Brix）。

1.1.2.2 分离驯化培养基（L）

麦芽汁（8°Brix）及酵母蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）：配方：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，若制固体培养基，加入2%琼脂粉。

1.1.2.3 初筛培养基

TTC上层培养基为TTC0.05g，葡萄糖0.5g，水1L；TTC下层培养基为YPD琼脂。

1.1.2.4 复筛培养基

加杜氏小管的YPD培养基。

1.1.2.5 酵母菌鉴定培养基

培养基配方及其配制，参考《The Yeast》[4]和《常见与常用真菌》[5]。

1.1.2.6 酵母菌保藏用培养基

马铃薯琼脂培养基，分离出的菌种保存在麦芽汁琼脂培养基试管斜面上，每隔两个月转接一次。

本研究中培养基除特别注明外均采用121℃蒸汽灭菌30 min。

1.1.3 实验试剂

1.1.3.1 原麦芽汁

取自湘乡市燕京（国人）啤酒有限公司（原麦芽汁13°Brix）。

1.1.3.2 酶制剂

a-淀粉酶：酶活力3 000 IU/g，糖化酶：酶活力17 400 IU/g。

1.1.3.3 其他化学试剂

放线酮、乙胺、尸胺、硫酸铜、酒石酸钾钠、次甲基蓝、亚铁氰化钾、葡萄糖、乙酸锌、氢氧化钠、盐酸、甲基红、醋酸铅、硫酸钠、乙醚等均为分析纯。

1.1.4 实验仪器

UV-2550紫外分光光度计：日本岛津制作所；电子天平：梅特勒电子仪器有限公司；超净工作台：江苏净化设备厂；立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安；HPS-250生化培养箱：哈尔滨市东明；LDZX-50FAS恒温水浴箱：上海瑞仰净化装备有限公司；QYC-21全温空气摇床：上海福玛实验设备有限公司；显微镜：江南光电等。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

从各个基质中采用随机取样原则收集样品，装入200 mL锥形瓶装100 mL无菌水，加入玻璃珠以及所采集的样品放置在调速多用振荡器（HY4）振荡1 h，打碎菌胶团，释放游离菌。

1.2.2 富集培养

在震荡后的菌悬液中取5 mL样品分别加入到已灭菌的含10%（体积分数）酒精的培养基中，40℃培养24 h，再转入酒精浓度为14%（体积分数）的培养基中，40℃培养72 h，镜检。若有则取1 mL接入YPD固体平皿中，40℃培养2 d～3 d，待长出菌落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离2次～3次，经镜检为纯种后分别转入YPD固体斜面，冰箱保存。

1.2.3 酵母菌的筛选

1.2.3.1 酵母菌一级筛

TTC法[6]：在一定培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层TTC显色剂后会显不同颜色，产酒精能力强的酵母菌落成深红色，次之为粉红色。将分离得到的各菌株依次接入TTC下层培养基的平皿中，培养24 h，长出菌落然后倒入TTC上层培养基，40℃下保温（阴暗处）2 h～3 h。比较各菌株之间的产酒精能力。初筛出性状优良的酵母菌株。试验重复3次。

1.2.3.2 酵母菌二级筛

酵母菌的二级筛：将酵母菌分别接入带有杜氏小管的不同的YPD液体试管中，添加不同浓度酒精下40℃培养，分别在12、24 h和48 h观察杜氏小管中产气情况。试验重复3次。

1.2.3.3 酵母菌三级筛

麦芽汁发酵法：二级筛选出的菌株活化后接入麦芽汁培养基中增菌使活菌浓度达到107个/mL，然后取6 mL装入300 mL带滤芯的发酵瓶中，加入200 mL麦芽汁40℃下培养72 h，每日称重，记录每日失重情况，待发酵结束时计算总失重，并对发酵液进行分析（可溶性固形物，酒精度，还原糖）。试验重复3次，复筛得到性状最为优良的菌株。

1.2.4 酵母菌的鉴定

酵母鉴定方法参考《The Yeast：a taxonomic study》（第三版），对其进行形成及培养特征观察，同时进行发酵糖类、同化碳源、同化氮源及无维生素生长试验。

1.2.5 酒精度的测定

取100 mL成熟发酵醪，加入100 mL蒸馏水，蒸馏出100 mL液体，摇匀后用酒精计和温度计分别测定其酒度和温度，然后查表校正为20℃酒精浓度。

2 结果分析

2.1 初筛结果

本实验将采集的样品置于含10%乙醇培养基中，使在含酒精培养基的不生长的菌株被淘汰掉，而能适应的菌株被保留下来，富集及驯化培养的主要目的是使目标菌株能够适应其生长环境并旺盛生长。从不同地区不同地点共采集样品12份，从中共分离得到酵母菌144株，其中来自各种腐败水果的酵母32株；来自葡萄园里土壤的酵母20株；来自菜市场甜酒糟的酵母34株；来自啤酒厂酒醪的酵母21株；来自学生食堂下污水的酵母12株；来自教学用酵母菌25株。分离酵母结果见表1。

表1 酵母菌的分离初筛结果Table 1 Segregation of yeast screening results

从表1可看出，菜市场甜酒糟和各种腐败水果中酵母菌数量较多，分离到的能耐14%（体积分数）酒精的菌株也多；葡萄园里土壤和污水由于菌项复杂，含有的微生物种类较多，但分离到的能耐14%（体积分数）酒精的菌株较少。

2.2 酵母菌的筛选

2.2.1 酵母菌的一级筛

将144株酵母菌采用无菌操作制备成菌悬液，用接种针分别接种于YPD固体培养基中，每个平板接15株～20株，于恒温培养箱中40℃培养，待长出菌落后，倒入配好的TTC溶液，覆盖菌落，40℃再继续培养，注意及时观察菌落的颜色变化，比较各菌株间的颜色深浅。TTC（2，3，5-氯化苯基四氮哇）是一种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低[6]。颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力，从每一平板中记下颜色较深的1株～2株菌，作为二级筛的出发菌株，共得到12株酵母菌。

2.2.2 酵母菌的二级筛

一级筛得到12株性状较好的菌株，在培养基中添加不同含量的酒精，在40℃下进行二级筛实验，重复3次，其产气结果见表2。

2.2.3 酵母菌的三级筛

由三级筛结果可看出TJ-18号酵母的酒精产率比较高，达到5.9%（体积分数）；残还原糖约为1.00%，糖利用率较高，且发酵力突出，72 h CO2失重为10.4 g。故后续研究将TJ-18菌为最终发酵用菌株。

2.3 酵母菌的初步鉴定

2.3.1 TJ-18菌株的形态和培养特征

TJ-18菌株在YPD液体培养基中（38℃）培养24 h细胞呈椭圆形或卵圆形，细胞大小（3.5～5.5）μm×（5.25～8.75）μm。繁殖方式为一端出芽。再生孢子培养基38℃培养9 d后有子囊孢子形成，每个子囊含1枚～2枚子囊孢子，无明显颜色。在YPD琼脂培养基上生长的菌落为乳白色、平滑、有光泽、边缘整齐。在加盖片的玉米淀粉培养基培养38℃培养8 d后形成假菌。

表2 二级筛实验结果Table 2 Level two screening test results

表3 三级筛实验结果Table 3 Level three screening test results

2.3.2 生理生化试验

2.3.2.1 发酵糖类试验

采用麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖及半乳糖做发酵糖试验，其结果见表4。

表4 TJ-18发酵糖类实验结果Table 4 TJ-18 fermentation of sugars in experimental results

2.3.2.2 同化碳源试验

TJ-18同化碳源实验结果见表5。

表5 TJ-18同化碳源实验结果Table 5 TJ-18 carbon source assimilation experiments

2.3.2.3 同化氮源试验

TJ-18同化氮源实验结果见表6。

2.3.2.4 辅助生理生化试验

TJ-18辅助生理生化实验结果见表7。

根据生理生化试验结果，并对照《TheYeasts：ataxonomicstudy》（第三版）对酵母的描述，TJ-18为酵母属的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。故将其命名为Saccharomyces cerevisiae TJ-18。

表6 TJ-18同化氮源试验结果Table 6 TJ-18 assimilation of nitrogen source test results

表7 TJ-18辅助生理生化实验结果Table 7 TJ-18 auxiliary results of physiological and biochemical

3 结论

本研究从自然界中分离得到的一株优良的酒精生产菌株TJ-18，酒精产率比较高，达到5.9%（体积分数）；残还原糖约为1.00%，糖利用率较高，且发酵力突出，40℃培养72 h，CO2失重为10.4 g，表现出很好的发酵产酒精能力。同时也对优势菌株的传代稳定性进行了考察，将得到的优势菌株分别接种到斜面培养基上传代5次，均表现出较好的传代稳定性。

微生物菌种质量的好坏对发酵工业有着及其重要的影响，这一研究的技术关键在于获得高渗透压且酒精发酵速率快、耐酒精和耐高温的酵母菌种，这也是人们的研究热点。TJ-18在实验过程中表现出较好的耐高温和耐酒精特性，但是对具体适合该菌株的培养条件其它特性还不是很清楚，在后续实验有待进一步研究。

[1] 刘畅,王涛,石翠芳.耐高温酵母菌的筛选及特性研究[J].酿酒,2007,34(2):52-53

[2] 刘海臣,张敏楠,阮时雷,等.多样品耐高温产乙醇酵母的筛选及生长特性研究[J].食品科技,2008,33(3)18-19

[3] 陈思耘.酵母生物化学[M].山东:山东科学技术出版社,1990:12

[4] KREGER N Y W.The yeasts:a taxonomic study[M].Third re-vised and enlarged edition.The Netherlands:Elsevier sciencepublishers B.V,1984

[5]中国科学院微生物研究所.常见与常用真菌[M].科学出版社,1978

[6] 王梅,张澎湃,帅桂兰,等.TTC在黄酒酵母选育中的应用[J].酿酒,2001,28(5):62-64