马钱子碱贴膏剂的抗肿瘤作用研究*

黄莉莉，王欣，李磊，陈军，蔡宝昌

1南京大学医学院附属鼓楼医院，南京　210008；2南京中医药大学药学院，南京　210023

马钱子碱贴膏剂的抗肿瘤作用研究*

黄莉莉1，王欣1，李磊2，陈军2，蔡宝昌2

1南京大学医学院附属鼓楼医院，南京210008；2南京中医药大学药学院，南京210023

摘要目的：评价马钱子碱贴膏剂的抗肿瘤作用。方法：采用H22荷瘤小鼠模型，按高（240mg· kg-1）、中（120mg·kg-1）、低（60mg·kg-1）三个剂量给予马钱子碱贴膏剂，测定抗肿瘤作用及毒性。结果：与空白对照组相比，马钱子碱贴膏剂中剂量（120mg·kg-1）和高剂量（240mg·kg-1）对H22荷瘤小鼠肿瘤生长抑制差异有显著性，中浓度的抑制率达到46.5%。马钱子碱贴膏剂未观察到具有免疫抑制作用和体重减轻作用，也未观测到血液毒性。结论：马钱子碱贴膏剂具有抗肿瘤药效，并且应用安全。

关键词马钱子碱；贴膏剂；经皮给药；抗肿瘤

现代研究表明，马钱子碱（brucine）是毒性中药马钱子成分中药理活性较高且毒性较低的生物碱成分，在抗肿瘤、镇痛方面作用显著[1-2]。将马钱子碱研制成治疗癌性疼痛的新型外用制剂——马钱子碱贴膏剂[3-4]，有利于改善透皮吸收，发挥药效。

本实验研究前期已通过小鼠热板法和醋酸扭体法等镇痛实验模型确定了马钱子碱贴剂的有效镇痛剂量为60 mg·kg-1，因此在镇痛剂量下考察马钱子碱贴剂的动物体内抗肿瘤作用具有重要意义。药物体内抗肿瘤作用研究多采用移植性肿瘤模型，也是筛选抗肿瘤新药中最常用的模型。目前所应用的大多数抗肿瘤药物都是通过此类模型实验而被广泛采用。移植性肿瘤模型，接种存活率高、个体差异小、生长速度快、试验时间短、易于客观判断疗效，多采用小鼠移植瘤。

肝癌H22瘤株生长迅速，癌细胞增殖比例高，倍增时间短，对抗癌药物较敏感，为常用的移植性肿瘤模型的癌细胞瘤株。因此本实验选择该模型，考察马钱子碱贴膏剂在不同剂量下对H22荷瘤小鼠模型的抗肿瘤作用，以确定有效剂量，同时考察其对免疫系统及造血系统的毒性。

1　仪器与材料

1.1仪器

BS124S电子天平（德国赛多利斯公司）；层流洁净工作台（YJ2875，苏州净化设备总厂）；XS-800i型血细胞分析仪（日本SYSMEX公司）；酶联免疫检测仪（model680，Bio-Rad公司）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移（AST）定量检测试剂盒（ELISA）、尿素氮（BUN）定量检测试剂盒（ELISA）（均美国R&D公司）。

1.2试药

马钱子碱贴膏剂（自制，具体制备与含量测定方法参见文献[4]，马钱子碱含量为3.15 mg·cm-2）；顺铂（Cisplatin，CDDP）注射粉针剂（20 mg/支），齐鲁制药厂，批号：0310035；等渗氯化钠注射液（南京小营制药厂生产，批号：04062204）。

1.3实验动物与瘤株

ICR小鼠，6～8周，雄性，体重18～22 g，由南京中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2007-0001；肝癌细胞株H22为南京市鼓楼医院提供，由本实验室定期腹腔接种传代；小鼠肉瘤S180细胞株为南京凯基生物科技发展有限公司提供提供，由本实验室定期腹腔接种传代。

2　实验方法

2.1肿瘤接种

小鼠常规饲养。另取传代保种7 d，肿瘤生长旺盛，且无溃破的健康腹腔接种H22肿瘤细胞的小鼠，颈椎脱臼处死，在超净工作台上从腹腔抽出乳白色浓稠腹水瘤液，用等渗氯化钠注射液按1∶3～1∶5比例制成肿瘤细胞悬液，计数并调节细胞数为2×107/L，每只小鼠接种0.2 mL（前肢腋窝皮下）。

2.2分组及给药

小鼠接种后随机分组，马钱子碱贴剂组设3个剂量组：高（240 mg·kg-1）、中（120 mg·kg-1）、低（60 mg·kg-1），及空白基质组（按高剂量贴剂给药面积计即2 cm2）、阳性药顺铂组（3 mg·kg-1，ip）；每组10只小鼠。其中贴剂给药组及空白基质组于腹部机械脱毛，尽量不损伤腹部皮肤。接种24 h后贴剂组及空白基质组腹部给予相应面积贴剂，并以医用胶带外裹固定防止小鼠撕咬。阳性药顺铂组腹腔注射给药。各给药组均为每日给药1次，每天观察记录小鼠生活状况并称体重，连续给药10天。

2.3指标测定

H22荷瘤小鼠于末次给药后禁食不禁水12 h以上，第11天经眼眶取血后处死，小心剥离瘤块、胸腺和脾脏，分别称重记录。计算胸腺指数和脾脏指数，并汇总每组小鼠10天给药期间平均体重变化；抽取的血液经枸橼酸钠抗凝用于血细胞分析仪测定血常规指数：白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）。根据下面公式计算抑瘤率（Tumor inhibitory rate，TIR）等。

3　实验结果

3.1对H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用

实验结果见图1。由结果可知，马钱子碱贴膏剂对H22荷瘤小鼠表现出明显的抑瘤作用，瘤重明显减轻。与空白对照组相比，马钱子碱贴膏剂中剂量（120 mg·kg-1）和高剂量（240 mg·kg-1）组对H22荷瘤小鼠肿瘤生长抑制差异有显著性；低剂量组（60 mg· kg-1）有一定的抑瘤效果，但是与空白基质组相比差别不明显。其中马钱子碱贴膏剂在60、120、240 mg· kg-1剂量时的抑瘤率分别为18.09%、46.5%和43.92%。阳性药顺铂的抑瘤率为89.29%。

3.2对H22荷瘤小鼠体重的影响

各组小鼠11天内平均体重变化曲线图（生长曲线图）见图2。结果表明与空白基质组相比，阳性药顺铂组在给药10天内体重明显下降；而马钱子碱贴膏剂组平均体重与空白基质组一样呈缓慢增长趋势，对小鼠无体重抑制作用。

3.3对H22荷瘤小鼠免疫器官重量及指数的影响

从图3、图4可以看出，与空白基质组相比，阳性药顺铂组小鼠的胸腺、脾脏重量及其指数均明显低于空白基质组，表明顺铂对小鼠的免疫器官具有明显的抑制作用；而马钱子碱贴膏剂中剂量（120mg· kg-1）和高剂量（240 mg·kg-1）组，对H22荷瘤小鼠的胸腺及脾脏指数均有一定的增加作用。而低剂量（30 mg·kg-1）组作用不明显。这提示马钱子碱对小鼠免疫器官无明显的抑制作用。

图1　不同剂量马钱子碱贴膏剂经皮给药后H22荷瘤小鼠的瘤重

图2　不同剂量马钱子碱贴膏剂经皮给药后对H22荷瘤小鼠体重的影响

图3　马钱子碱贴膏剂对H22荷瘤小鼠胸腺指数的影响

图4　马钱子碱贴膏剂对H22荷瘤小鼠脾脏指数的影响

3.4对H22荷瘤小鼠血常规指数的影响

从表1可以看出，5 mg·kg-1的顺铂注射液可明显降低H22荷瘤小鼠的白细胞数和血小板数，说明顺铂对小鼠免疫和造血系统有着明显抑制作用；而马钱子碱贴膏剂高、中、低剂量组对H22小鼠的白细胞及血小板均无明显影响。说明短期内60～240 mg· kg-1的马钱子碱贴膏剂对其造血系统和免疫系统没有明显影响。

表1　马钱子碱贴膏剂对H22荷瘤小鼠血常规指数的影响（±s，n=10）

表1　马钱子碱贴膏剂对H22荷瘤小鼠血常规指数的影响（±s，n=10）

注：统计学比较采用t检验，以空白基质组为对照，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

组别剂量（mg·kg-1）白细胞（WBC）×109/L红细胞（RBC）×1012/L血红蛋白（HGB）×g·L-1血小板（PLT）×109/L空白基质组25.28±9.626.96±0.81104.67±13.001722.33±260.41阳性药组58.32±2.76**10.49±0.69**168.33±10.61**326.5±95.60**低剂量组6018.5±6.776.94±0.5386.00±38.161993.17±248.10中剂量组12025.05±9.687.81±0.75115.33±10.171896.83±52.27高剂量组24022.48±5.517.26±0.9787.58±37.141814.5±216.24

4　讨论

有研究表明，马钱子碱及其脂质体注射液[5]在移植性小鼠肿瘤模型中对肿瘤生长有着显著的抑制作用。本文首次采用马钱子碱贴膏剂这一外用经皮给药制剂观察了马钱子碱对肝癌H22的肿瘤抑制作用，考察其抗肿瘤的有效剂量，以期采用贴膏剂这种缓释制剂达到降低马钱子碱的毒性并提高其抗肿瘤的作用。从结果可以看出，马钱子碱对H22荷瘤小鼠表现出明显的抑瘤作用，在120 mg·kg-1时抑瘤作用最佳。

实验还系统考察了马钱子碱贴膏剂对H22荷瘤小鼠免疫器官、造血系统的毒性以及对体重的影响（免疫器官重量、体重、白细胞数、红细胞数的下降均可认为是药物的毒性）。结果发现马钱子碱贴膏剂在各给药剂量下对荷瘤模型小鼠的免疫器官和造血系统均未产生明显的抑制作用或进一步的损伤。

本文研究表明，马钱子碱贴膏剂对移植性肿瘤模型具有明显的抑瘤作用，而且没有西药抗肿瘤药所具有的副作用，如明显的减轻体重、抑制和损害造血系统和免疫系统等，这些特点使马钱子碱贴膏剂成为一种具有开发前景的抗肿瘤新药剂型。体外研究表明，马钱子碱对人肝癌细胞疗效确切[2]，因此未来的研究还应采用裸鼠移植人肝癌模型评价马钱子碱贴膏剂的抗肿瘤效果。

参考文献

[1] Yin W,Wang TS,Yin FZ,et al.Analgesic and antiinflmmatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted fromseeds of Strychnosnux-vomica[J].J Ethnopharmacol,2003,88:205-14.

[2] Deng XK,Yin W,Li WD,et al.The anti-tumor effects of alkaloids fromthe seeds of strychnosnux-vomica on HepG2 cells and its possible mechanism[J].JEthnopharmacol,2006,106:179-86.

[3] 陈军，李磊，祁艳，等.羟丙基-β-环糊精对马钱子碱贴膏剂药剂学性质的影响[J].中草药，2012，43（11）：2168-72.

[4] 陈军，李磊，祁艳，等.马钱子碱贴膏剂的制备与药物动力学研究[J].中药材，2012，35（8）：1295-8.

[5] 瞿叶清，郭玉琴，哈惠馨，等.马钱子碱隐形脂质体与普通脂质体的抗肿瘤作用比较[J].中药新药与临床药理，2008，19（5）：361-3.

中图分类号R965.1

文献标志码A

文章编号1673-7806（2014）05-398-03

*基金项目科技部十一五重大新药创制项目（2009ZX09103-342）

作者简介黄莉莉，主管药师Tel:025-83304616E-mail:gracehuang_1999@sina.com

收稿日期2014-04-15修回日期2014-06-10

Evaluation of Antitumor Efficacy of Hydrogel Patches Containing Brucine*

HUANG Li-li1,WANG Xin1,LI Lei2,CHEN Jun2,CAI Bao-chang2
1The Affiliated DrumTower Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008;2School of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine Nanjing 210023

ABSTRACTObjective：To evaluate the antitumor efficacy of hydrogel patches containing brucine.Methods：Brucine hydrogel patches were administered by dermal route to H22tumor-bearing mice at the dose of 240,120 and 60 mg·kg-1,respectively.Tumor inhibition ratio and toxicity were observed.Results：Significant inhibition ratios were obtained following administration of 120 and 240 mg·kg-1.The tumor inhibition ratio of 120 mg·kg-1dose group was determined to be 46.5%.No immune inhibition effect and body weight reducing effect were observed,neither was hematological toxicity.Conclusions：Brucine hydrogel patches might be safe and effective for the application of antitumor therapy.

KEY WORDSBrucine;Hydrogel patches;Dermal administration;Antitumor