蛇足石杉内生真菌清除DPPH·与抑制乙酰胆碱酯酶活性研究

董丽辉等

摘要：为了从蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.）Trev.]中分离出能产生清除DPPH·和抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的内生真菌，采用平板分离蛇足石杉内生真菌，摇瓶发酵并测定其发酵液和菌丝体提取物清除DPPH自由基、抑制乙酰胆碱酯酶活性的能力，形态学和ITS-rDNA序列分析法鉴定获得的部分内生真菌。结果表明，共分离得到94株内生真菌，有31株内生真菌发酵产物显示出乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中18株具有显著的抑制活性，

关键词：蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.）Trev.]；DPPH·；乙酰胆碱酯酶；内生真菌

中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）04-0888-06

Effects of Endophytic Fungi Isolated from Huperzia serrata on Scavening DPPH· and AchE Inhibitory

DONG Li-hui1，FAN San-wei1，LING Qing-zhi1，QIAN Hai-feng1，WEI Zhao-jun2

（1.Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo 315100，Zhejiang，China；

2.School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei Universuity of Technology，Hefei 230009，China）

Abstract： The endophytic fungi isolated from Huperzia serrate by plate were fermented and identified by morphological characters and ITS-rDNA sequence. The effects of the extracts from fermented broth and mycelium on DPPH· scavenging ratio and inhibition ratio for AchE were investigated. The results showed that 94 endophytic fungis were isolated from Huperzia serrate 31 strains of them exhibited inhibition activity to AChE， while 18 strains isolated from stem（9）， leave（8） and root（1） had significan inhibition rate ranged from 50.3% to 82.78%. The fermentation of 5 strains such as S22， S29， L44， S79 and S94 had both activity of AchE-inhibitory and antioxidant. Through ITS-rDNA sequence analysis the five strains were identified as Arthrinium sp.， Podospora sp， Trichoderma sp.， Colletotrichum sp. and Colletotrichum sp.， respectively. It is indicated that there are endophytic fungi with antioxidant and AchE inhibitory activity in Huperzia serrate.

Key words： Huperzia serrate； DPPH·； AChE； endophytic fungi

蛇足石杉[Huperzia serrata（Thunb.）Trev.]属于石杉科（Huperiaceae）石杉属（Huperzia Bernh.）的蕨类植物，近年的研究[1-5]表明，蛇足石杉的主要药效成分——石杉碱甲（Huperzine A）是一种强效的乙酰胆碱酯酶（Actylcholinesterase，AchE）抑制剂，用于治疗重症肌无力，能改善老年性记忆功能减退，与其他同类产品相比，副作用小[6]，是目前临床上用于治疗老年性痴呆症（Alzheimers disease，AD）的最有效的药物。研究表明，石杉碱甲能够保护神经元细胞对抗β-淀粉样蛋白产生的毒性，并提高超氧化物歧化酶（SOD）的产生[7，8]。据研究报道，石杉碱甲能通过刺激超氧化物歧化酶（SOD）的产生而加快氧自由基的清除，减少自由基损伤，保护细胞免受损伤，从而起到治疗老年性痴呆的作用[9]。因乙酰胆碱酯酶抑制剂和抗氧化剂均有治疗老年性痴呆症的作用，所以筛选过程中可以将具有抑制乙酰胆碱酯酶活性和抗氧化功能作为筛选的依据。

由于野生的蛇足石杉生长非常缓慢，其资源稀少，并且全草中的石杉碱甲含量仅在0.006%～0.012%，石杉碱甲的人工合成品尚无临床活性，目前石杉碱甲的来源完全依赖野生资源，所以寻找新的石杉碱甲的来源尤为迫切。近年来，国内的学者从石杉科植物中分离筛选出数株产石杉碱甲的内生真菌[10-12]。从内生真菌的分离研究结果发现，蛇足石杉的内生真菌的种类繁多，内生菌的数量也非常大，这使筛选目标菌株的工作量非常大，目标菌株的命中率低。

本试验对蛇足石杉植株茎、叶、根内生真菌进行了分离、纯化与鉴定，在前期研究的基础上，以具有抑制乙酰胆碱酯酶活性和清除DPPH自由基活性为双重筛选目标，对分离得到的内生真菌进行筛选，取得了可喜的结果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为采自浙江天目山脉的药用植物蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.） Trev.]。

1.2 仪器与试剂

Multiskan Spectrum型多功能酶标仪（美国Thermo Labsystems公司）；XSP-C型生物电子显微镜（上海上光新光学科技有限公司）；电泳仪及电泳槽（美国Bio-Rad公司）；PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；3730测序分析仪（美国ABI公司）。

碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide，ATCI）、5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸（Dithiobis-nitrobenzoic acid，DTNB）、乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）均为Sigma公司产品；无水乙醇等试剂均为国产分析纯；ITS-rDNA引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 方法

2 结果与分析

2.1 内生真菌种类及其在蛇足石杉体内的分布

从蛇足石杉中共分离到94株不同内生真菌，这些内生菌在植株中分布结果详见表1。其中茎中所含内生真菌最多，为49株，占总菌株数的52.13%；其次为叶片的38株，占40.43%；根内最少，仅7株，占7.45%。

在对蛇足石杉植株进行内生真菌分离过程中发现，茎和叶的内生真菌要比根丰富，从根部分离到的内生真菌数量较少，仅7株，占7.45%。可见内生真菌在植物组织具有不同的生理分布，另一方面可能是根和叶片对消毒剂更加敏感，因此在消毒过程中，应该根据不同的组织材料选择最佳的消毒时间。

对分离获得的94个内生真菌，根据其菌落大小、形态、颜色以及菌丝和孢子的显微特征，可将其归属为Penicillium sp.、Cladosporium sp.、Colletotrichum sp.、Acremonium sp.、 Mortierella sp.、 Paraconiothyrium sp.、 Leptosphaeria sp.、 Shiraia sp.、 Arthrinium sp.、Podospora sp.等12个属，其中Penicillium sp.，Colletotrichum sp.、Podospora sp.为优势类群，占总菌数的22.34%、14.89%、14.89%。其中茎部分离到的49株菌分布在这12个属中的10个属，并且在Penicillium sp.中占有很大的比重，叶中分离到的38株菌也分布在10个属中，并且在Podospora sp.中占有最大的数目，根分离到内生真菌7株涉及5个属（表1）。结果显示蛇足石杉的内生真菌有丰富的物种多样性。

2.2 内生真菌菌丝体提取物和发酵液提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性

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