正交试验优化锁阳中3种有效成分的提取工艺

(湖北省荆州市妇幼保健院药剂科，湖北 荆州 434020)

锁阳 Cynomorium songaricum Rupr.为锁阳科锁阳属多年生肉质寄生草本植物，药用部位是全草，又名“不老药”“锈铁棒”“沙漠人参”等，药食两用，主要分布于土壤缺乏有机质而富含盐分的荒漠地带，主产于甘肃、新疆、青海、宁夏、内蒙古等地[1]。锁阳中，所含儿茶素具有提高免疫功能、抗氧化等活性；没食子酸具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用；原儿茶酸具有增加冠脉流量、降低心肌耗氧量的作用，在体外具有明显抑制血小板聚集的活性和抗菌活性[2-3]。笔者以儿茶素、没食子酸、原儿茶酸的含量为评价指标，参考文献[4-6]，采用 L9(34)正交试验法优选提取工艺，确定最佳提取条件，旨在为锁阳药材的合理开发和充分利用提供科学依据。

1 仪器与试药

Waters 600型高效液相色谱仪，Waters 996 photodiode Array Detector二极管矩阵检测器，Millennium 32色谱工作站(美国Waters)；Metter AE 240型十万分之一电子天平；SK5200H型超声波提取器(上海科导超声仪器有限公司)；Anke TGL-16B型离心机(上海安亭科学仪器厂)。儿茶素对照品(批号为110877-200001)，没食子酸对照品(批号为110831-200302)，原儿茶酸对照品(批号为110809-200503)，均由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯(天津四友)，水为灭菌注射用水，其余试剂均为分析纯；锁阳药材及饮片均经兰州大学药学院马志钢教授鉴定为 Cynomorium songaricum Rupr.。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法建立

2.1.1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，2.5 μm)；流动相:乙腈-水-36%乙酸(8∶92∶0.1)；流速:1.0 mL/min；检测波长:258.7 nm；柱温:室温；进样量:20 μL。外标法定量，在此条件下，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.1.2对照品溶液制备

称取儿茶素、没食子酸、原儿茶酸对照品适量，精密称定，置同一10 mL容量瓶中，加灭菌注射用水适量，超声10 min，加水至刻度，配制成含儿茶素0.118 g/L、没食子酸0.126 g/L、原儿茶酸0.147 g/L的混合对照品溶液。另取儿茶素、没食子酸、原儿茶酸对照品适量，加灭菌注射用水，分别制成含儿茶素4.945 1 g/L、没食子酸0.208 g/L、原儿茶酸0.040 g/L的对照品贮备液。

2.1.3方法学考察

线性关系考察:精密吸取混合对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mL，分别置5 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，依次取稀释后的混合对照品溶液及未稀释的混合对照品溶液20 μL进样，按拟订色谱条件测定。以对照品进样量(X，μg)为横坐标、峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线并回归处理，得回归方程，儿茶素 Y=82 466.81 X+281.83，r=0.999 9；没食子酸Y=886294.46X+1485.33，r=0.9996；原儿茶酸 Y=2136116.67X+5 884.29，r=0.999 8。结果表明，对照品进样量儿茶素在0.047～1.510 μg范围内、没食子酸在 0.050～1.613 μg范围内、原儿茶酸在0.059～1.882 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

精密度试验:分别精密吸取同一混合对照品溶液，连续进样6次，每次20 μL。结果峰面积的 RSD儿茶素为0.93%(n=6)，没食子酸为0.86%(n=6)，原儿茶酸为1.12%(n=6)。

重复性试验:按样品含量测定方法，取同一批样品(东风场区饮片)6份，按最佳工艺提取，按样品含量测定项下方法测定。结果儿茶素的含量为10.25 mg/g，RSD为0.79%(n=6)；没食子酸的含量为0.403 mg/g，RSD为0.60%(n=6)；原儿茶酸的含量为0.078 mg/g，RSD为1.12%(n=6)。

稳定性试验:取同一供试品溶液，避光放置，分别在制备后0，2，4，6，8，10 h 时依法进样测定。结果峰面积的 RSD 儿茶素为1.01%(n=6)，没食子酸为0.77%(n=6)，原儿茶酸为0.69%(n=6)，表明供试品溶液在避光条件下10 h内稳定。

加样回收试验:取已知含量(儿茶素10.25 mg/g，没食子酸0.403 mg/g，原儿茶酸0.078 mg/g)的样品(东风场区饮片)1.0 g，精密称定，共取6份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入儿茶素、没食子酸、原儿茶酸对照品储备液各2.0 mL，另精密加入注射用水4 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液并测定含量，计算回收率。结果儿茶素平均为回收率为98.56%，RSD=1.3%(n=6)；没食子酸平均回收率为100.53%，RSD=1.1%(n=6)；原儿茶酸平均回收率为98.34%，RSD=1.6%(n=6)。

2.2 提取工艺优化

以溶剂种类(因素A)、溶剂用量(因素B)、提取时间(因素C)为考察因素，设置因素水平，见表1。采用 L9(34)正交表进行试验并进行方差分析，结果见表2和表3。在进行数据分析时，除表3所列的显著性差异外，原儿茶酸(Ⅱ)含量的方差分析结果无显著性差异。可见，各因素对3种成分提取的影响大小不同，对没食子酸依次为B＞A＞C，对原儿茶酸依次为A＞C＞B，对儿茶素依次为A＞C＞B。溶剂种类比较时，虽然儿茶素在50%的甲醇提取物中含量最高，但分离困难、峰形很差，而水提物中没食子酸、原儿茶酸含量最高；溶剂用量比较时，容积用10 mL时，原儿茶酸、儿茶素含量最高；提取时间比较时，提取30min时原儿茶酸、儿茶素含量最高。因此，确定最佳工艺条件为B1C3A1，即将10 mL水加入2 g锁阳粉中，超声提取30min。

表1 因素水平表

2.3 样品含量测定

取锁阳粉末(过40目筛)约2.0 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，精密加入灭菌注射用水10mL，称定质量，超声处理30min，放冷，再称定质量，离心(12 000 r/min)5 min，上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，置棕色瓶中，即得。依上述方法制备7批供试品溶液，分别取配制好的对照品溶液和供试品溶液，精密吸取20 μL进样，用峰面积按外标法计算锁阳药材、饮片中儿茶素、没食子酸、原儿茶酸的含量。结果见表4。

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析结果

2.4 最佳工艺验证试验

取3批样品，按优选工艺提取，结果见表5。RSD＜2.5%，表明优选的提取工艺条件基本稳定。

表4 样品含量测定结果(mg/g，n=2)

表5 最佳工艺验证试验结果(mg/g，n=3)

3 讨论

在流动相的优化中，选用了乙腈-水系统的不同配比(25∶75，40∶60，10∶90，18∶82，5∶95，3∶97，4∶96，8∶92)，选用了甲醇-水系统的不同配比(20∶80，50∶50)，选用了乙腈-水-36%乙酸系统的不同配比(5∶95∶0.3，5∶95∶0.1，8∶92∶0.1，7∶93∶0.1，6∶94∶0.2，8∶92∶0.2)进行试验。结果随着乙腈体积分数的降低，儿茶素、没食子酸、原儿茶酸的保留时间增加，乙酸的加入使峰形更好。当乙腈-水-36%乙酸为8∶92∶0.1时能够获得好的分离效果和短的分离时间，故选择此流动相系统作为本试验的流动相。

由于儿茶素、没食子酸、原儿茶酸的含量差异较大，综合评价时用3种成分的含量之和作为评价指标不够科学、准确。9次正交试验中，儿茶素的平均含量为5.939 mg/g，没食子酸的平均含量是0.207 mg/g，原儿茶酸的平均含量是0.033 mg/g。用3种成分的含量之和作为评价指标时，更多地反映了含量较大的儿茶素的含量变化，有时会掩盖含量较小的没食子酸和原儿茶酸的含量变化。如何更好、更科学、更准确地评价和优化多种成分的提取工艺，有待进一步研究。

参考文献：

[1]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海人民出版社，1997:2 395.

[2]陶 晶，屠鹏飞.锁阳茎的化学成分及其药理活性研究[J].中国中药杂志，1999，24(5):292-294.

[3]张遵义.原儿茶酸衍生物的化学结构与冠脉流量、心肌耗氧量关系的探讨[J].药学学报，1980，15(11):641-643.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药

科技出版社，2010:325.

[5]易生富，陈 兵，孙亚楠.正交试验设计优化血脉通口服液水提工艺[J].医药导报，2014，33(3):382-385.

[6]张松亮，顾腾飞，于天杰.正交试验法优选胃乐舒颗粒的醇提工艺[J].中国药师，2014，17(1):165-167.