替加氟注射液无菌检查方法学研究

王刚林，周 剑

（1.重庆医疗器械质量检验中心，重庆 401147；2.重庆市食品药品检验所，重庆 401121）

替加氟为氟尿嘧啶的衍生物，能干扰、阻断DNA和RNA、蛋白质合成，主要作用于S期，是细胞周期特异性药物。其在体内经肝脏活化逐渐转变为氟尿嘧啶而起抗肿瘤作用，作用机制、疗效及抗瘤谱均与氟尿嘧啶相似，但作用持久、吸收良好、毒性较低，化疗指数为氟尿嘧啶的2倍，毒性仅为氟尿嘧啶的1/7～1/4，临床主要用于治疗胃癌、直肠癌、胰腺癌、原发性肝癌、乳腺癌等。替加氟注射液全国现有19个生产批文，规格均为5 mL∶0.2 g。笔者选用其中6个厂家生产的替加氟注射液进行了无菌检查方法学研究，现报道如下。

1 仪器与材料

KDGB330型一次性使用全封闭集菌器（杭州泰林生物技术设备有限公司）。替加氟注射液（厂家A，四川三精升和制药有限公司，批号为 070502；厂家 B，齐鲁制药有限公司，批号为703002EU；厂家 C，陕西省秦光制药厂，批号为 070211；厂家 D，天津金耀氨基酸有限公司，批号为608201；厂家E，山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号为70107302；厂家F，哈药集团生物工程有限公司，批号为 20070102。规格均为每支 5 mL∶0.2 g）。硫乙醇酸盐流体培养基（批号为090118），改良马丁培养基（批号为090706），营养肉汤培养基（批号为090322），均由中国药品生物制品检定所提供，经灵敏度试验符合2010年版《中国药典（二部）》规定[1]。试验菌株为金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色假丝酵母菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，于30～35℃培养24 h；接种白色假丝酵母菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养48 h。上述5种培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数小于100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养7 d，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。上述菌悬液每次试验前均新鲜配制，备用。

2.2 需氧菌、厌氧菌检查方法验证试验

根据文献[2]试验方法进行试验。取单个滤筒12个，分成3组，每组4个，将规定量的供试品（陕西省秦光制药厂，批号为070211，规格为 5 mL∶0.2 g）按每一滤筒中过滤 5支供试品，再用pH＝7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，1组滤筒不进行冲洗，另 2组每膜冲洗总量分别为 100 mL（分2次冲洗）、200 mL（分3次冲洗）。冲洗完毕后，将硫乙醇酸盐培养基加至滤筒中，再在每一组滤筒中分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌4种试验菌液各1mL。另取4个装有同体积培养基的容器，分别加入4种试验菌液1 mL，作为阳性对照。于适宜条件下培养2～7 d，逐日观察记录。结果见表1。可见，采用薄膜过滤法，每膜冲洗总量为100 mL并分2次冲洗，适用于本品的需氧菌、厌氧菌无菌检查。

2.3 真菌检查方法验证试验

抗肿瘤类药物对真菌无抑菌作用，故采用规定量的供试品（陕西省秦光制药厂，批号为 070211，规格为 5 mL∶0.2 g）对真菌检查方法进行了考察。取单个滤筒2个，将规定量的供试品按每一滤筒中过滤5支供试品，不进行冲洗。完毕后，将改良马丁培养基加至滤筒中，再在滤筒中分别加入黑曲霉、白色假丝酵母菌2种试验菌液各1 mL。另取2个装有同体积培养基的容器，分别加入2种试验菌液1mL，作为阳性对照。于适宜条件下培养2～7 d，逐日观察记录。结果见表2。可见，采用薄膜过滤法，直接薄膜过滤而不冲洗，适用于本品的真菌无菌检查。

2.4 方法确认

由于各个厂家的产品处方工艺均存在一定的差异，故采用6个厂家各1批样品对2.2项和2.3项确定的方法进行了确认。结果见表3。可见，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌均于24h内生长良好，白色假丝酵母菌、黑曲霉均于72 h内生长良好。

3 讨论

试验结果表明，替加氟注射液对试验菌中金黄色葡萄球菌的生长有一定抑制作用。参考文献[3]，对其方法学进行研究，结果显示，采用薄膜过滤法，用适量冲洗液冲洗，阳性对照菌选用金黄色葡萄球菌的方法是可行的。由此，建立的替加氟注射液无菌检查方法为:将规定量样品薄膜过滤后，真菌培养管和需氧菌、厌氧菌培养管及阳性对照管每膜采用不少于100 mL的冲洗液冲洗后，再加入适宜的培养基，以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌，依法进行无菌检查。

表1 薄膜过滤法冲洗量考察结果

表2 薄膜过滤法冲洗量考察结果

注射剂作为药品的一种重要剂型，被广泛应用于临床，由于其直接注入人体体内而发挥疗效，因此其安全性显得更为重要。现阶段注射剂的质量越来越受到高度关注，而注射剂的灭菌是关系到药品质量、保证用药安全的重要工艺步骤之一，应选择合适的灭菌方法，既能杀灭、除去微生物而达到灭菌的目的，又能保持药物稳定。因此，无菌检查是检查灭菌效果的主要手段，也是注射剂质量控制的重要指标。

表3 各厂家产品试验菌生长情况考察结果

本试验中按照方法验证的一般程序[2]，对替加氟注射液的无菌检查法进行了系统研究。由于本品为氟尿嘧啶的衍生物，属于抗肿瘤类药物，对各试验菌均无明显抑菌作用，且各厂家产品处方工艺均存在一定的差异，故先选取处方较复杂的陕西省秦光制药厂（处方为无水碳酸钠、无水亚硫酸钠、活性炭）的1批样品进行试验。试验过程中发现，本品对金黄色葡萄球菌有较弱的抑制作用，而对其他试验菌无抑菌作用。故选取金黄色葡萄球菌作为阳性敏感菌，并通过加大冲洗量的方法优化试验条件。通过试验，确定取规定量样品、薄膜过滤后用0.1%蛋白胨缓冲液冲洗100 mL时，能够很好地消除其抑菌作用。同时，用所建立的方法对其他5个厂家的5批样品进行方法确认，结果均能达到检查要求，最终确定该方法适合于替加氟注射液整个品种的无菌检查。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京:化学工业出版社，2010:附录Ⅺ H.

[2]钱文静，张 玫.常见抗菌药品无菌检查中有关冲洗量的探讨[J].江苏药学与临床研究，2005，13（3）:63-65.

[3]姚 华，李秋菲，李惠娥，等.伊曲康唑注射液无菌检查方法研究[J].中国药业，2009，18（3）:20-21.