高效液相色谱法同时测定人血浆中异烟肼、乙酰异烟肼和吡嗪酰胺的浓度*

张亮，钱智磊，陆磊，侯文洁，王洁

南京市胸科医院药学部，南京 210029

高效液相色谱法同时测定人血浆中异烟肼、乙酰异烟肼和吡嗪酰胺的浓度*

张亮，钱智磊，陆磊，侯文洁，王洁**

南京市胸科医院药学部，南京 210029

目的：建立高效液相色谱法同时测定人血浆中异烟肼、乙酰异烟肼和吡嗪酰胺的浓度。方法：色谱柱为Inertsil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm），以甲醇∶0.05 mol·L-1磷酸二氢钾（三乙胺调pH 5.6）为流动相，柱温：40℃，流速：1.0 mL·min-1，进样体积：20 μL，检测波长：268 nm。结果：3组分在线性范围内与峰面积线性关系良好（r2＞0.9940），日内、日间精密度RSD＜10%，平均回收率在80%～120%。结论：本方法专属性好，样品处理简单，符合生物样品分析要求。

高效液相色谱法；异烟肼；乙酰异烟肼；吡嗪酰胺；血药浓度

本文使用HPLC法同时测定血浆中INH、Ac-INH和PZA并进行了方法学研究。

1 仪器与试药

LC-20AB高效液相色谱系统（检测器为SPDM20A，日本岛津）；电子分析天平（EB224，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

异烟肼对照品（批号：100578-200401，中国药品生物制品检定所）；吡嗪酰胺对照品（批号：100178-200403，中国药品生物制品检定所）；乙酰异烟肼对照品（批号：3-JES-102-4，Toronto Research Chemicals Inc.)。

甲醇为色谱纯；磷酸二氢钾、三乙胺为分析纯；水为自制双蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）∶0.05 mol·L-1磷酸二氢钾（B，三乙胺调pH 5.6）（梯度为1 min～10 min：A∶B为2∶98，10 min～11 min梯度变为A∶B为80∶20，11 min：A∶B为80∶20，淋洗时间共25 min）；检测波长：268 nm；柱温：40℃；流速：1 mL·min-1；进样体积：20 μL。

2.2 血浆样品处理

取血浆样品300 μL放入2 mL离心管中，加甲醇700 μL，涡旋混合5 min，15000 r·min-1离心15 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后转移至自动进样器小瓶中。

老徐笑：五年前，第一回见到你就感觉你特别，坐在轮椅上，比谁都爱说爱笑；我跟老伴说，也没见女孩的妈妈跟来陪读，可怜见的，问你，你说学校已经挺照顾你，把你安排在一楼的宿舍，还敲掉一小段台阶，修了个可供轮椅出入的坡道。“妈妈嘛，有妈妈的事，是我不要她陪的。要不然我再大一点，也不会洗床单，不会晒被子。”

2.3 方法专属性试验

按照本实验方法，INH、AcINH和PZA有较好的分离，互不干扰测定，血浆中的杂质峰对样品的测定也没有影响。色谱图见图1。

图1 INH、AcINH和PZA的色谱图

2.4 线性关系考察

精密称取对照品适量置于10 mL量瓶中，加入甲醇超声溶解并稀释至刻度，配成浓度分别为INH 1000 μg·mL-1、AcINH 1000 μg·mL-1、PZA 10000 μg·mL-1的标准储备液。分别在9份300μL的空白血浆中，加入一定量的标准储备液，使血浆中药物浓度为0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μg· mL-1。按“2.2”项下方法操作，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作线性回归，结果见表1。

表1 3组分回归方程和线性范围

2.5 精密度和准确度试验

分别于300 μL的空白血浆中加入标准储备液，精确配制成含低、中、高3种不同INH（0.5、5、25 μg·mL-1）、AcINH（0.5、5、25 μg·mL-1）、PZA（0.5、5、25 μg·mL-1）浓度的血浆样品，按“2.2”项下方法操作，测定日内（5次）和日间（5 d）精密度，RSD均小于10%。见表2。

2.6 稳定性考察

于300 μL的空白血浆中加入标准储备液，精确配制成含INH（0.5、5、25 μg·mL-1）、AcINH（0.5、5，25 μg·mL-1）、PZA（0.5、5、25 μg·mL-1）浓度的血浆样品，分别在室温下放置0、2、4、8、12 h后按“2.2”项下方法操作，测定样品峰面积和内标峰面积的比值。由表3可见，测定样品基本保持稳定。

表2 精密度及回收率试验（n=5）

表3 稳定性试验结果（n=5）

2.7 回收率试验

分别于300 μL的空白血浆中加入标准储备液，精确配制成含低、中、高3种不同INH（0.5、5、25 μg·mL-1）、AcINH（0.5、5、25 μg·mL-1）、PZA（0.5、5、25 μg·mL-1）浓度的血浆样品，按“2.2”项下方法操作，每个浓度测5次，计算平均回收率和RSD。见表2。

3 血药浓度检测的应用

本方法成功用于30例口服INH和PZA患者的血药浓度检测。服药方法为INH 0.3 g每日1次，早饭后半小时顿服；PZA 0.5 g每日2次早晚饭后半小时服。早饭后2.5小时采集血样，并于3小时内分析完毕，不能及时测试的保存在-40℃冰箱内。从测试结果看，患者血浆中的药物浓度差异较大。INH血药浓度在0.37～5.8 μg·mL-1（1.8±0.59 μg·mL-1），AcINH血药浓度在0.34～3.1 μg·mL-1（1.63±0.52 μg·mL-1），PZA血药浓度在2.58～14.18 μg·mL-1（6.98±2.86 μg·mL-1）。

4 讨论

目前已有多种高效液相色谱（HPLC）的方法同时测定血浆中的多组分抗结核药，但普遍使用了离子对试剂[3-4]。本课题组在反复试验后发现在反相色谱中使用离子对试剂有如下几点不足：（1）需要较长的柱平衡时间；（2）实验重现性较差；（3）离子对试剂对色谱柱的损害较大；（4）使用成本过高。这导致了此种方法事实上很难用于临床大量血浆样本的常规检测。所以，在尝试了多种缓冲对后最终选择了磷酸缓冲盐。虽然在分离度方面略微低于离子对试剂，但依然能够达到专属性试验的要求，很方便地用于临床大量血浆样本的检测。

液相-质谱联用（LC-MS）拥有超高的选择性和灵敏度可以同时分析血浆中的多种药物[5]，但使用成本过高在医院尚未普及。因此，使用HPLC技术对多种抗结核药及其代谢物进行血药浓度监测依然是最常用和最经济的方法，在本实验中，INH、Ac-INH和PZA由于极性较强，导致在色谱柱上保留时间过短，且易受血浆杂质的影响。为了获得良好的分离度和峰形，本实验曾尝试使用苯基柱和氰基柱，虽可延长保留时间但峰形欠佳。曾尝试以pH=6的磷酸二氢钾为缓冲对，在高极性流动相的洗脱下可以实现样品的分离，但此时AcINH拖尾较严重，导致和INH的分离度达不到1.5。最终采用pH=5.6的磷酸缓冲时，AcINH拖尾不明显，与INH的分离度能够达到1.5。

在血浆样品处理方法中，曾尝试用乙酸乙酯萃取，但由于这3种组分的极性过大而弃用。还尝试将沉淀蛋白后的上清液吹干用流动相复溶，但需额外加入抗氧化剂，影响了多组分药物的稳定性。最终使用甲醇沉淀蛋白后直接取上清液迅速进样。该法无需吹干复溶，因此既避免样品氧化，又简化了操作步骤，便于临床大批量样本的检测。

本实验方法简单、准确、成本较低，保留时间较为合适。如果使用250 mm的C18柱还可以延长保留时间，增加分离度。整套方法回收率高于80%，日间和日内RSD小于10%，完全符合生物样品分析要求，可以用于临床药物检测及药物动力学研究。本方法可作为抗结核药物测定的参考。

[1] World Health Organization.Treatment of Tuberculosis: Guideline for National Programmers[EB/OL].3rd ed., 2003,Geneva.

[2] 郎美琦，蒋利，黄佳盛.抗结核病药物治疗综述[J].临床肺科杂志，2010，15（8）：1153-4.

[3] Khuhawar MY,Rind FMA.Liquid chromatographic determinationofisoniazid,pyrazinamideandrifampicin from pharmaceutical preparations and blood[J].Chromatogr B,2002,766(2):357-63.

[4] Zhou ZF,Chen LY,Liu P,et al.Simultaneous determination of isoniazid,pyrazinamide,rifampicin and acetylisoniazid in human plasma by high-performance liquid chromatography[J].Anal Sci,2010,26(11):1133-8.

[5] Gong Z,Basir Y,Chu D,et al.A rapid and robust liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for simultaneous analysis of anti-tuberculosis drugs--ethambutolandpyrazinamideinhumanplasma[J].Chromatogr B,2009,877(16):1698-703.

DeterminationofIsoniazid,AcetylisoniazidandPyrazinamideinHuman Plasma by HPLC*

ZHANG Liang,QIAN Zhi-lei,LU Lei,HOU Wen-jie,WANG Jie**
Department of Pharmacy,Nanjing Chest Hospital,Nanjing,210029

Objective：To determine the concentrations of isoniazid,acetylisoniazid and pyrazinamide in human plasma by RP-HPLC.Methods：The HPLC method was carried out on an Inertsil ODS-SP(4.6× 150 mm,5 μm)column with 0.05 mol·L-1KH2PO4(adjusting PH to 6.0 with triethylamine)-methanol as mobile phase.The column temperature was 40℃,the flow rate was 1.0 mL·min-1and the detection wavelength was 268 nm.Results：All calibration curves had good linearity(r2＞0.99)within their tested ranges. The intra-and inter-day precision was within 10%,the extraction recovery was between 80%and 120%.Conclusion：The method is sensitive,simple and rapid.It is suitable for analyzing the drugs in biological samples.

HPLC;Isoniazid;Acetylisoniazid;Pyrazinamide;Plasma concentration

R969.1

A

1673-7806（2014）02-112-03

南京市科委药学基金（常州四药临床药学研究基金），编号：2013YX015；南京市医学科技发展重点项目（编号：ZKX13041）

张亮，男，药师 E-mail:zhshhine310@163.com

**通讯作者 王洁，女，主任药师 E-mail:13905165431@163.com

2013-10-28

2013-12-10