不同检疫处理方法对常州地区拟出口花木介质土中真菌的处理效果比较

王丽萍 陈文俊 郑安明 李东明

摘要[目的]比较不同检疫处理方法对常州地区拟出口花木介质土中真菌的处理效果。[方法]以常州嘉泽镇花木种植基地的介质土为材料，对样本中的真菌种群进行分离、鉴定和分析，并研究热处理、微波辐射、熏蒸处理3种不同检疫处理方法对土壤微生物的抑制效果。[结果]从该地区的花木土壤中分离、纯化和鉴定到包括青霉属（Penicillium）等的17属58种真菌；60、80、100 ℃的热处理能较好地杀死或灭活介质土中的微生物；微波处理和熏蒸处理对土壤微生物有明显抑制效果。[结论]利用较高温度处理土壤（100 ℃）、长时间的微波辐射和密闭熏蒸是较好的土壤处理方法。

关键词介质土；真菌；鉴定；检疫处理

中图分类号S184文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00080-03

作者简介王丽萍（1986-），女，江苏常州人，农艺师，硕士，从事植物检疫研究，Email：wlpsbc@126.com。

收稿日期20130903花卉苗木业是目前世界农业最具活力的产业之一，全球年贸易额高达2 000亿美元，并以每年10%的速度递增。以嘉泽为代表的常州花卉苗木业2005年突破30亿元，农民人均收入达到8 000多元，目前产区总面积达21 333 hm2，年销售额超60亿元。随着第八届中国花博会在常州武进的顺利举行，常州花木“向外走”的呼声也越来越高。但除了在2007年向美国出口过一批12 000株的红叶石楠外，几乎没有出口。花木出口最大的障碍在于国外检疫机构对我国出口的花木尤其是携带的介质土设置了严格的检疫要求。如何对介质土进行科学的检疫处理，使其达到国外所规定的相关检疫要求，破除花木出口的贸易壁垒，是急需解决的问题。为此，笔者对常州嘉泽镇花木种植基地土壤中的真菌群落进行了初步分离和鉴定，分析了花木基地的土壤真菌群落结构，并研究了热处理、微波辐射、熏蒸处理3种不同检疫处理方法对土壤微生物的抑制效果，以期为花木出口企业进行检疫处理、土壤管理、栽培管理提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1供试土壤。试验土壤于2013年5月采自常州嘉泽花木基地。取5～15 cm层的土样，置于冰盒，带回常州出入境检验检疫局有害生物实验室进行真菌分离、高温处理、微波辐射、熏蒸等处理。

1.1.2培养基和培养液。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 ml，高温高压灭菌。土壤浸渍培养基：1 000 g土壤浸于1 000 ml水，充分混匀后1∶5对水加入蔗糖10 g做成1 L营养液和琼脂培养基。土壤摇菌培养液：1 000 g土壤浸于1 000 ml水，充分混匀后1∶5对水加入蔗糖10 g做成1 L营养液。

1.1.3试剂。DNA提取、ITS引物合成、PCR等分子生物学常用试剂购于上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1 土壤真菌的分离和鉴定。将同一地区采集的土样混合均匀，过直径为2 mm的筛，将较大土块和植被的枝叶筛掉，共取10 kg，置于100 ml无菌水中30 ℃、200 r/min悬浮30 min，用稀释平板分离法[1]进行土壤真菌分离。将单胞稀释分离出的菌落培养于PDA培养基48 h后，进行形态学等的观察和DNA提取，DNA提取参考刘少华等[2]的方法。PCR反应体系（总体积为50 μl）：0.2 mmol/L dNTPs，0.5 mmol/L ITS1和ITS4引物，2.0 mmol/L Mg2+，1 U Taq酶，10倍缓冲液5 μl，DNA 10 ng左右。PCR循环：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min。DNA测序服务由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2.2 土壤热处理。在常压下，将已预处理的介质土在60、80、100 ℃条件下分别处理2、4、8 h，以不处理作为空白对照。然后取处理好的土壤1 g，加入装有培养液的三角瓶中，30 ℃振荡培养，分别培养6、12、24 h后再取培养液放入分光光度计中测定OD600，以培养0 h的样品为对照。

1.2.3 介质土无害化微波处理。在常温常压状态下，将已预处理的介质土放在2 450 MHz频率的微波条件下分别处理1、2、5 min，以不处理作为空白对照。然后取处理好的土壤1 g，加入装有培养液的三角瓶中，30 ℃振荡培养，分别培养6、12、24 h后再取培养液放入分光光度计中测定OD600，以培养0 h的样品为对照。

1.2.4 介质土无害化熏蒸剂处理。在常温常压状态下，用含量不低于98%的溴甲烷气体分别处理介质土6、12、24 h，剂量为240 g/m3，以不处理作为空白对照。介质土厚度不超过30 cm，处理后充分散气。取处理好的土壤1 g，加入装有培养液的三角瓶中，30 ℃振荡培养，分别培养6、12、24 h后再取培养液放入分光光度计中测定OD600，以培养0 h的样品为对照。

2 结果与分析

2.1 花木基地土壤真菌的种群组成通过对常州嘉泽花木基地土壤样品中的真菌分离和纯化，共鉴定出17个属58个种真菌，分别是：青霉属（Penicillium）15个种，木霉属（Ttrichoderma）8个种，曲霉属（Aspergillus）7个种，镰孢属（Fusarium）5个种，毛霉属（Mucor）4个种，枝顶孢属（Acremonium）3个种；枝孢菌属（Cladosporium）、疫霉属（Phytophthora）、毛壳菌属（Chaetomium）、被孢霉属（Mortierella）、粘帚霉属（Gliocladium）各2个种，金孢属（Chrysoporium）、腐质霉（Humicola）、轮枝菌属（Vertillium）、漆斑菌属（Myrothecium） 、茎点霉属（Phoma）和丝核菌属（Rhizoctonia）各1个种。其中，青霉属、木霉属、曲霉属、镰孢属在该花木基地土壤中的种类、数量较多，分别占菌株总数的25.86%、13.79%、12.07%和8.62%，是该基地土壤的优势真菌菌群。

2.2土壤热处理对土壤微生物的影响由图1～图3可知，60 ℃不同时间处理的土壤微生物在6～12 h生长不明显，24 h后与0 h比较生长显著，但明显慢于未处理对照；80 ℃不同时间处理的土壤微生物在0～6 h生长不明显，12 h后与0～6 h比较生长显著，但明显慢于未处理对照；100 ℃处理后的土壤微生物基本不生长，与0 h比较生长不显著，未处理对照生长量显著。

对土壤的消毒处理措施较多，该研究选取了简单、快捷、易行的几种措施，都取得较好的效果，其中利用较高温度处理土壤（100 ℃）、长时间的微波辐射和密闭熏蒸是较好的土壤处理方法，对土壤微生物的抑制效果非常显著。在高温作用下，许多病原菌会被直接杀死，如白菜软腐病菌在50.0 ℃下10 min即死亡、油菜菌核病的菌核在50.0 ℃下5 min即死亡、根结线虫在47.5 ℃下15 min即死亡等。短时间或长时间的热处理使土壤深层温度达到一定高度，对杀死土壤中的病原菌作用较大。冯忠民等阐述了利用太阳能热处理土壤来治理连作障碍的原理[4]。微波辐射也是直接杀死微生物的有效措施，不仅利用在土壤杀菌技术上，在土壤或生态环境的修复等方面也应用广泛。微波辐射杀死了土壤中的微生物，对土壤的有机质含量、pH变化产生影响，从而影响土壤肥力[5]。土壤熏蒸是设施栽培很好的土壤消毒处理方法，能有效缓解土壤的盐渍化、连作障碍等。根据《蒙特利尔议定书哥本哈根修正案》的相关规定，我国作为发展中国家，将在2015年禁用溴甲烷等对臭氧消耗严重的物质[6]，新型高效土壤消毒剂有待研发。张腾等研究了1，3二氯丙烯、二甲基二硫、威百亩、甲酸甲酯4种熏蒸剂对土壤微生物的影响，其中甲酸甲酯和二甲基二硫在影响微生物数量及微生物生物量氮方面效果明显[7]。

该试验的热处理、微波处理和熏蒸处理结果有助于指导花木出口企业采取正确的检疫处理措施，使土壤中病原菌数目下降到不至于引起作物病害造成检疫风险或经济损失的程度。微波处理效果显著，无公害，但前期投入较大，使用成本较高，相信随着技术的改良和普及会成为一种重要的检疫处理方法；熏蒸处理法作为一种传统的检疫处理方法，效果明显，但随着溴甲烷等熏蒸剂的禁用，目前已不适宜继续推广；热处理简单实用，无污染，适合在具备热处仓的企业或口岸进行推广。

参考文献

[1] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，2004.

[2] 刘少华，陆金萍，朱瑞良，等.一种快速简便的植物病原真菌基因组DNA提取方法[J].植物病理学报，2005，35（4）：362-365.

[3] 赵风艳，吴凤芝，刘德，等.大棚菜地土壤理化特性的研究[J].土壤肥料，2000（2）：11-13.

[4] 冯忠民.陈云槐.徐钦辉，等.利用太阳能热处理治理连作障碍[C]//植物保护与农产品质量安全论文集.北京：中国农业科技出版社，2008：152-154.

[5] 赵永富，郑正，袁守军，等.施用辐照处理污泥对观赏植物生长的影响[J].安徽农业大学学报，2005，32（1）：36-40.

[6] UNEP MBTOC.Report of the methyl bromide technical options committee[M].Nairobi：UNEP，2002：43-60.

[7] 张腾，燕平梅，李园，等.4种熏蒸剂对土壤微生物特性的影响[J].中国农学通报，2013，29（3）：116-120.