西瓜抗病基因工程研究进展

摘 要：西瓜是一种重要的世界性园艺作物，但生产中病害严重，抗病种质资源匮乏，遗传基础狭窄，常规抗病育种进展缓慢，利用基因工程改良其抗病性具有重大意义。笔者从西瓜离体培养、遗传转化系统、抗病基因工程中相关目的基因、常用转基因方法、导入目的基因的种类、转基因植株的表现和转基因产品的安全性等方面对西瓜抗病基因工程研究进展做一综述，并进一步提出和讨论了该领域尚待解决的问题，以期为通过基因工程手段改良西瓜抗病性提供帮助。

关键词：西瓜；抗病基因；基因工程；安全性

中图分类号：S651，Q78 文献标志码：A 论文编号：2013-0758

Abstract： Watermelon is an important horticultural crop worldwide， but there are many diseases in its production. For the narrow genetic base， watermelon conventional breeding for disease resistance has been slow. In this paper， watermelon resistance gene cloning， establishment and optimization of tissue culture and genetic transformation system， commonly used transgenic methods， types of target genes into transgenic plants' performance and the safety of genetically modified watermelon research progress were summarized. Some problems in this field， which would be investigated further， were also pointed out and discussed. These conclusions will contribute to genetic engineering application in improving watermelon disease resistance.

Key words： Watermelon； Resistance Gene； Gene Engineering； Security

0 引言

西瓜[Citrullus lanatus （Thunb.） Mansfeld]是具有重要经济价值的葫芦科（Cucurbitaceae）作物，世界各地广泛栽培，在全球十大果品中排在第5位。目前西瓜栽培中普遍存在病害严重的问题，各栽培区主要病害可达10多种，其中尤以枯萎病等土传性病害危害严重[1]。对于病害的防治主要采用化学防治，但由于生产中连作现象严重，病源变异广泛，防治效果不佳。抗病性是衡量一个品种好坏的重要指标，如果品种本身抗病性较差，其他优良性状也无从体现。由于抗病育种材料严重缺乏，西瓜抗病育种研究工作进展缓慢[2]。

20世纪80年代初首例转基因烟草的问世标志着植物基因工程的成功，经过30年的发展，植物基因工程的理论和实践逐步走向成熟和完善，并成为现代生物技术的核心领域，亦是农作物品种改良的重要手段。基因工程在增加作物产量、提高品质、增强对生物和非生物逆境的抗性方面取得了重大突破，经济和社会效益明显。统计数据显示，全球转基因作物商业化种植面积在1996—2011年的15年间呈现连续增长势头，2011年全球共有29个国家种植转基因作物，面积达到创纪录的1.6亿hm2，生产的农作物价值超过1600亿美元，转基因研究及其产业化发展显示出了蓬勃的生机。通过转基因技术来增强植物的抗病性是基因工程的一个重要方面，对于西瓜等遗传基础狭窄的园艺作物而言这一途径显得更为重要，笔者将对西瓜抗病基因的克隆、遗传转化体系和导入的抗病目的基因类型等几个方面的进展做一综述，为基因工程在西瓜抗病育种中的应用提供参考。

1 西瓜自身抗病基因筛选和克隆

获得抗病基因是利用基因工程改良作物抗病性的第一步，对西瓜抗病基因的克隆工作主要集中在相关分子标记的开发上，针对的病害主要包括枯萎病、病毒病、炭疽病、白粉病等，如与西瓜抗枯萎病1号生理小种[3]和抗西葫芦黄叶病毒等[4]相关基因的SCAR标记相继被发现。目前真正获得直接相关的抗病基因尚未见报道，西瓜抗病基因工程中的目的基因大多来源于其他物种，相关分子标记的深入研究使得抗病基因的克隆成为可能，如徐向丽等[5]利用RAPD和SSR标记技术将抗西葫芦黄叶病毒基因zym-CH初步定位在遗传图谱3号连锁群105 cM处，但总的来说目前获得的分子标记多态性较差[6]，和抗病基因的距离较大，使得对这些标记的有效利用较为困难，急需开发新的多态性更强的分子标记。Levi等[7]指出不同西瓜种质间丰富的单核苷酸多态性（SNP），这一特点使得获取更多抗病基因相关分子标记成为可能，其他研究者的结果表明微卫星标记、RGAs标记等在西瓜中的多态性也较为丰富[8-10]，上述这些研究为西瓜抗病基因的定位与克隆奠定基础，也可作为抗病辅助选择的分子标记。

2 西瓜转基因方法研究

2.1 西瓜离体再生体系的研究

目前除种质转化系统外几乎所有的转基因方法均需要经过组织培养阶段，这一过程涉及到外植体的选取、抗性植株的再生、外源基因功能的初步验证等各方面。高效的离体再生系统是植物基因工程获得成功的有效保障。目前关于西瓜组织培养的研究报道较多，但结论不尽相同。总体来看，与其他同类植物相比，西瓜的离体再生能力率不高，玻璃化现象较为严重，再生苗不易移栽成活。

2.1.1 激素种类和浓度的影响 大多数研究者认为BA在西瓜外值体不定芽诱导分化过程中作用重要，在培养基中加入较低浓度的生长素对这种分化有一定的促进作用[12-15]，但也有不同的结论，如Compton等[16]认为BA浓度的变化对于西瓜不定芽的诱导影响轻微，添加IAA后诱导产生的愈伤组织生长过度，不定芽的分化则会被抑制，其他研究者的试验[17]表明，即使在不提供任何激素的1/2MS培养基上外植体也可以获得再生，只是这种分化所需时间相对较长。

2.1.2 品种基因型和植株苗龄的影响 不同基因型的品种再生率明显不同，在用西瓜不同品种子叶作为外植体的研究中已证明了这一点[18]，目前大多数相关研究均支持这一观点。处于不同苗龄的植株，离体培养过程即使选用同样部分的外植体，其生理状态也不尽相同，这对于外植体的再生率影响也极为重要。研究表明西瓜苗龄5天时外值体诱导率最高，但不同基因型间存在较大差异，超过10天苗龄的子叶诱导不定芽极为困难[19]，也有研究者认为西瓜7天苗龄的子叶诱导效果最好[20]，张志忠等[13]提出西瓜苗子叶处于转色期的诱导率最高，这种鉴别方法避免了由于基因型、种子质量和培养条件差异而导致的以天数来衡量苗龄的不足。

2.1.3 不同类型外植体的影响 在西瓜离体培养研究中，茎、叶和体胚等外植体均有成功报道[21]，但各种类型的诱导率不尽相同，如Eissa等[22]认为子叶更容易诱导，Islam等[23]则认为胚轴较子叶更为有效。总的来看，目前在西瓜离体培养和基因转化工作中子叶块和顶芽是最为常用的外植体类型[24]。其他，如原生质体[25]和体胚等外植体类型的诱导[26]也有相关研究，这类报道虽少，但增加了西瓜组织培养和转基因工作中可用外植体的来源，有助于各种技术地充分运用。

西瓜离体培养中严重的玻璃化现象是必须引起重视的，这一情况在大多数研究中几乎都会出现[25]，严重时会导致整个研究工作的彻底失败。培养基和激素类型、琼脂浓度、渗透调节物质、通气情况等均与此有关，如质量浓度高的BA会加剧试管苗的玻璃化[21]，培养基中添加硫胺素则会在一定程度上缓解这一情况[27]。西瓜再生苗诱导生根较为容易，但获得的不定根质量不佳，数目偏少，且在移栽过程中极易断裂，这在很多程度上影响了西瓜的组织培养研究工作[12]。由此可见，尽管西瓜离体培养研究工作已进行多年，相关报道也较多，但不同研究者获得的结论差异较大，难以很好的重复，这说明其组织培养技术仍有待于进一步深入研究。

2.2 西瓜遗传转化体系的研究

2.2.1 西瓜遗传转化方法的研究 目前西瓜基因工程中最常用的转化方法为农杆菌法，Choi等[28]在1994年首次报道了高效的农杆菌介导的西瓜遗传转化系统，此后不同的研究者先后对这一系统进行了优化和改进，目前已较为成熟。西瓜基因枪遗传[29]和发根农杆菌[30]转化系统也有报道。近年来外源DNA直接转化法在西瓜中获得成功，肖光辉等[31]通过DNA浸胚将瓠瓜总DNA转入西瓜，王果萍[32]和包文风等[33]均通过柱头涂抹法成功将外源基因导入西瓜中；通过对T3代的田间自然抗病性和人工接菌鉴定获得3个枯萎病抗性株系[32]。由此可见利用花粉管通道法等直接导入技术是可行的，这类方法操作简单，不需要经过组织培养阶段，转化周期大为缩短，一旦将外源基因导入这些细胞，即可获得较为稳定的转化体。

2.2.2 西瓜农杆菌介导的遗传转化法 对农杆菌转化条件进行的优化包括预培养时间、共培养时间、菌液浓度、侵染时间和辅助物质的添加等内容。张志忠等[34]对西瓜农杆菌法进行了深入系统研究，指出利用子叶为外植体的遗传转化体系指标为对子叶块外植体进行2～3天的预培养，侵染用工程菌液OD600值为0.3，侵染时间10 min，共培养时间为4天，其他研究者的结论也大致类似。基因工程试验中需要通过适当的选择压力将转化个体筛选出来，一般采用抗生素或除草剂来实现这一目标。植物基因工程中常用的抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、链霉素、四环素和潮霉素等，研究表明15 mg/L的潮霉素筛选抗性芽较为合适，卡那霉素会增加玻璃化比例，500 mg/L头孢霉素和羧苄青霉素均可用于共培养后的脱菌过程[34-35]，但也有研究者认为卡那霉素更适合筛选西瓜抗性芽[36-37]。不同来源材料的最佳侵染时间需经试验确定，过长会由于培养环境缺氧导致外植体腐败死亡，过短侵染效率低，转化难以发生；此外培养基中是否需要添加酚类物质、小分子量糖类和乙酰丁香酮等也属于这部分的研究内容，对于转化率不够高的受体系统，这些研究显得非常必要，有时甚至对转化事件的发生起决定性作用。

3 抗病基因工程在西瓜中的应用

目前西瓜抗病育种工作中主要的问题是缺乏相应的抗病资源，这使得利用传统育种技术改良西瓜抗病性极为困难。利用基因工程将抗病基因导入西瓜，有望得到抗病品种或供进一步育种选用的材料，目前这类研究主要集中在抗病毒和真菌2个方面，但相对于番茄等园艺植物而言，西瓜的抗病基因工程研究突破较少，无论是在抗病基因的克隆还是转基因植株的利用等方面均存在一定差距，相关研究具有一定的困难，进一步深入探讨这一问题极为重要。

3.1 抗病毒病基因工程

病毒病是造成农作物减产的重要原因，全球每年因此造成的损失高达约200亿美元，西瓜遗传基础狭窄，常规杂交抗病毒育种进展缓慢。西瓜花叶病毒外壳蛋白基因[38]和银斑病毒外壳蛋白基因[27]先后被导入西瓜，与对照相比转基因株系发病时间推迟，发病程度减轻。鉴于病毒的多样性和易于变异，将多个病毒外壳蛋白基因同时导入西瓜是目前研究的重点[39-41]，同时导入西瓜花叶病毒CP基因、西葫芦黄叶病毒和黄瓜花叶病毒复制酶基因的4倍体转基因西瓜，目的基因在后代中能稳定遗传，经温室及大田接种鉴定，T3代转基因西瓜抗病毒性达中抗水平[39]；导入4个病毒外壳蛋白基因片段的转基因西瓜植株抗病性增强，可以抵抗多种病毒，但在转基因后代中部分基因片段丢失了[41]。关于西瓜抗病毒基因工程的报道较多，由最初的导入一个基因，逐步发展为同时导入多个基因；通过微小RNA转化增强抗病毒能力等新技术逐步发展起来，这些对于西瓜获得持久、广泛的抗病毒能力大有裨益。

3.2 西瓜抗真菌病害基因工程

植物生长发育过程中由真菌侵袭所致的病害所占比例最大，是严重影响园艺作物产量、质量的主要因素。经过多年的发展，植物抗真菌基因工程技术已日趋成熟。张志忠等[42]首先将来源于番茄的葡聚糖酶基因和几丁质酶基因同时转入西瓜，抗病性检测显示转基因植株的抗真菌能力有一定程度的提高，其他研究者也有类似的报道[43]。肖守华等[35]进一步添加了小麦硫堇蛋白基因，获得了3价抗真菌融合基因载化西瓜，转基因植株高抗真菌，人工接种病原菌后几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性较非转基因对照高5～6倍。此外，研究表明将瓠瓜DNA整体导入西瓜可以获得性状稳定的抗枯萎病育种材料[31]。

4 西瓜基因工程产品安全性研究

随着基因工程在园艺植物改良中的应用日趋普遍，转基因园艺植物的安全性问题也日益引起人们的重视，一个是环境安全性，另一个是食品安全性。环境安全性研究主要指对转基因植物释放到田间所可能引发的一系列风险的研究，为了防止转基因植物中外源基因扩散，必须实行风险评估，Kim等[43]通过小规模的田间试验证明了转基因西瓜中的外源基因会漂流到非转基因西瓜中去。食品安全性研究主要是对转基因植物本身和以转基因植物为材料所生产的食品被人畜食用后可能存在的风险进行的研究，由于园艺植物在人类食品中占有重要地位，是提供各种营养物质的主要来源，和人们健康水平息息相关，这类研究显得极为必要。应奇才等[45-46]对转抗病毒基因西瓜的农艺性状进行的研究显示，在长势、生物学性状、含糖量、越冬能力等性状上转基因植株和非转基因对照没有显著差异，其抵抗病毒的能力得到了显著提高；毒性试验、致突变试验和小鼠30天喂养试验表明转基因西瓜对小鼠没有毒性和致突变作用，属安全食品。这是目前仅见的3篇关于转基因西瓜安全性研究的报道，对于利用基因工程获得优良西瓜品种，进而进行推广种植而言，上述研究显然是不够的，需要进行更加深入的基础研究和更大规模的食品安全性检验。

5 展望

应该说西瓜抗病基因工程研究取得了令人鼓舞的成绩，但在抗病基因的克隆工作、获得转基因植株后的相关研究等方面存在一定不足，今后的研究工作应着重从以下几个方面入手。①深入研究西瓜的组织培养体系，尤其应重视对组培过程中的玻璃化问题探讨；②利用更为先进的分子标记等技术克隆西瓜新的抗病基因，这一工作可以结合最近完成的西瓜全基因组测序，优良的目的基因是西瓜抗病基因工程进一步应用的保障；③鉴于目前西瓜抗病基因工程中大多采用的是组成型表达模式，对于新型诱导性启动子和组织特异型启动子的克隆工作应给与高度重视，这方面的研究将在改良西瓜抗病性的同时尽可能减少对其他优良性状的影响；④同时将多个目的抗病基因导入西瓜，充分发挥其在抗病机制方面的协同作用，使转基因西瓜获得对不同病原的持久性抗性；⑤西瓜属于重要的园艺作物，食品安全性问题较为突出，对转基因产品更加可靠的安全性评价工作必须进行，无标记转化、利用自身来源基因进行转化等方面的研究将有助于解决这一问题。

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