秋水仙素诱导木薯多倍体研究进展

陆柳英等

摘 要：木薯优良品种选育一直是木薯科研工作的重要任务，多倍体育种为木薯种质创新和新品种选育提供了一条重要途径。笔者叙述了近年来国内外木薯多倍体育种研究进展。分析了国内外利用秋水仙素诱导木薯多倍体的技术方法、多倍体嵌合体分离策略以及鉴定手段，指出影响木薯多倍体诱导效果的几个因素，并提出了木薯多倍体诱导研究目前存在的问题和未来的研究方向。

关键词：木薯；多倍体；秋水仙素；研究进展

中图分类号：S533 文献标志码：A 论文编号：2013-0464

Abstract： Cassava breeding has been the key task in the cassava consortium； and polyploid breeding provides an important way for the germplasm innovation and breeding of cassava. This paper briefly reviewed the progress of cassava polyploidy breeding at home and abroad. Some factors， such as the methods of inducing polyploidy by colchicines， the identification of polyploid， the techniques of dissolving chimeras， were emphatically summarized. The problems existed and the potential focuses were also discussed here.

Key words： Cassava； Polyploidy； Colchicine； Progress

0 引言

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯属植物，属内有98个种，木薯是唯一的栽培种[1]。木薯淀粉含量高（20%～40%）、耐旱、耐贫瘠、耐酸性土壤，是热带地区第四大农作物和世界三大薯类作物之一。木薯可食用、饲用和作为工业原料，加工成淀粉、变性淀粉、酒精等，广泛应用于食品、医药、纺织、造纸、生物质能源等诸多行业。在中国其主产区分布于广西、广东、海南、云南、福建等热带、亚热带地区。

植物多倍体现象普遍存在自然界中，这是高等植物染色体进化的显著特征之一，是适应性变化和物种形成的主要机制[2]。染色体数目加倍，使多倍体个体通常表现出巨大性和营养成分高、抗逆性强、育性低的特点。木薯是良好的诱导多倍体作物。木薯多为二倍体，染色体数目为2n=36[3]，是无性繁殖、收获营养体（木薯块根）的作物。因此，木薯多倍体可通过直接选择、固定而获得，既有利于保持多倍体的稳定性，又能更好地利用多倍体的特点提高收获产量和植株抗性。

目前通过多倍体育种方法创造新的种质也成为了育种研究的热点之一，通过多倍体育种与传统育种方法相结合，选育出抗旱、抗寒、抗病、高产、高淀粉的木薯多倍体品种，对扩大种质资源和促进木薯产业发展有重要意义。

1 木薯多倍体诱导方法

多倍体植株的产生途径有自然产生和人工诱导。在自然条件下，机械损伤、射线辐射、温度骤变及其他一些化学因素刺激，都可以使植物材料的染色体加倍，形成多倍体种群。通过筛选自然多倍体获得新木薯品种的研究在国内外鲜有报道，尼日利亚伊巴丹曾发现1例由体细胞芽变产生的自然多倍体[4]，国内目前尚无有关木薯自然多倍体的报道[2]。

人工诱导方法有物理方法诱导、生物学方法诱导和化学方法诱导[5]。其中，以秋水仙素等化学药剂处理加倍染色体的方法诱变作用专一性强、诱变突变广谱、经济方便，成为目前应用最普遍的方法。

国外对木薯多倍体的研究较早，1941年Graner[6]使用秋水仙素对木薯进行多倍体诱导研究，鉴定到植株染色体数目为72条，为四倍体，气孔的平均长度为40 μm，而对照为28 μm。Abraham等[7]和Magoon等[8]也有采用秋水仙素人工诱导出木薯四倍体的报道。2006年Nassar[9]使用0.2%的秋水仙素溶液连续3次，每次间隔12 h，对包裹棉花的木薯腋芽进行处理，最终筛选获得了木薯多倍体植株。

在国内，木薯多倍体诱导也多采用化学方法。1980年，华南热带作物科学研究院橡胶栽培研究所遗传育种室，以优良甜种木薯6068为材料，采用混合化学诱变方法，获得稳定的四倍体突变新品种[10]。陈显双等[11]利用秋水仙素作为诱导剂，对8个木薯品种进行多倍体诱导试验。经形态学和染色体数目鉴定，变异后代显示出多倍体特征。

2 秋水仙素诱导木薯多倍体方法研究

秋水仙素诱导植物多倍体的方法包括田间诱导和离体诱导。

2.1 田间诱导

秋水仙素田间诱导多倍体采用的处理方法主要有浸渍法、滴液法和注射法。

浸泡法多用在诱导种子或植物枝条嫩芽上。王建岭[12]采用了种茎萌发芽浸泡药剂法诱导，将沙床上木薯茎段萌发的嫩芽，在出芽2 cm左右时，浸泡在装有秋水仙素溶液的小离心管中进行诱导处理。

滴液法可用于处理植物枝条芽点。陈显双[11]采用田间诱导方法，在木薯生长前期打顶，促进侧芽萌发，用脱脂棉包裹腋芽生长点，以4 g/L的秋水仙素为诱变剂，采用滴液法处理，获得变异枝条。

注射法可直接将秋水仙素溶液注射到需要诱导的植物部位。周香君等[13]采用微量进样器将3种不同浓度的秋水仙素溶液注射处理大蒜蒜瓣生长点，筛选出0.1%的秋水仙素处理后的大蒜根尖染色体变异和气孔的加倍效果表现最稳定。但此方法在木薯多倍体诱导研究在国内尚未见相关报道。

2.2 离体诱导

离体培养的材料一般是种子、幼苗、生长点、茎尖、愈伤组织、胚状体、悬浮细胞系、小孢子、原生质体或单细胞等。秋水仙素离体培养诱导多倍体常用的方法有浸泡法、混培法、点滴法。

张健[14]分别使用SC8和ARG7 2个木薯品种的带芽茎段、成熟子叶以及丛生芽为试验材料，用秋水仙素进行浸泡法和混培法处理，诱导木薯多倍体，均发现了染色体加倍现象。谭德冠等[15]采用点滴法，将无菌脱脂棉沾不同浓度的无菌秋水仙素溶液后，包裹‘刚果12号桉下胚轴诱导出的愈伤组织和丛生芽，每天点滴1次，处理3天后用无菌水冲洗干净后接种到新鲜培养基上，获得了四倍体变异株。

2.3 影响秋水仙素诱导木薯多倍体效果的因素

2.3.1 诱变材料 诱变材料在很大程度上决定着诱变的效率。诱变材料一般选取植株组织分裂最旺盛的时期和部位。如种子、幼苗、生长点、茎尖、愈伤组织、胚状体、悬浮细胞系、小孢子、原生质体或单细胞等。张健[14]在离体诱导多倍体研究中发现，同样使用秋水仙素混培法，木薯丛生芽的诱变效率明显高于带芽茎段和子叶切块。而采用浸泡法处理带芽茎段时，对带芽茎段先进行膨大培养3～5天可有效提高多倍体的诱变率。

2.3.2 诱导方法的选择 田间诱导和离体诱导方法都能诱导多倍体，在选择时要根据试验材料选择最佳的诱导方法。王建岭[12]在田间诱导多倍体试验中使用了2种方法，其中茎尖涂抹法优于萌发芽浸泡法。张健[14]在离体诱导多倍体时，采用浸泡法与混培法对SC8和ARG7木薯品种的带芽茎段、成熟子叶和丛生芽多倍体进行诱导，其中，木薯SC8品种采用浸泡法处理带芽茎段，诱变效果较好，诱变率达31.3%；而品种ARG7采用混培法处理丛生芽，诱变率较高，为36.7%。因此，不同基因型木薯间多倍体诱导率也存在较大差异。

2.3.3 处理浓度和处理时间 秋水仙素浓度是多倍体诱导的关键因素之一，浓度过低时不能产生加倍效果，而浓度过高又会抑制植物材料的生长甚至会导致死亡。陈显双[11]在田间木薯腋芽生长点诱导多倍体时，设定浓度范围0.5～8 g/L，浓度越大，变异效果越好，但浓度过大，对植株损伤程度也加大，以4～6 g/L处理效果最好。

处理时间的长短也会直接影响成活率和诱变率。王建岭[12]研究发现，浸泡法和混培法对组培芽茎尖诱导，在处理相对较短的时间内，成活率和诱变率比较高。如浸泡法处理2天后成活率最高达60%，诱变率最高达20%，处理4天后成活率最高仅10%，诱变率全部为0；混培法处理时间10天后成活率最高达50%，诱变率最高达30%，处理30天时，成活率最高达20%，诱变率全部为0。浸泡和混培对愈伤组织诱导时，随着处理时间的增加，成活率和诱变率均有明显下降趋势。

另外，在进行诱导处理时，适当添加二甲基亚砜（DMSO）、甘油等辅助剂，可提高染色体加倍效果和减轻诱变剂毒害作用。DMSO作为渗透剂和增效剂，添加浓度一般为2%～4%[16]。张健[14]在木薯离体诱导多倍体试验中，就在浸泡的秋水仙素溶液中添加了2% DMSO，取得了较好的诱变效果。

2.3.4 其他环境因素 光照情况对诱导率存在影响。由于秋水仙素见光易分解，整个诱导处理的过程都需在黑暗环境中进行。处理完成后，可将材料从暗培养到弱光培养、光照培养进行缓慢过度，有利于材料生长。张健[14]在秋水仙素离体诱导多倍体处理带芽茎段、成熟子叶切块、丛生芽试验中，采用浸泡法时，处理过程全部在遮光条件下完成，处理结束后将材料先暗培养3天，再弱光培养3天，最后转成光照培养；采用混培法时，处理过程也需在弱光条件下进行。

温度也对诱变率存在影响。一定范围内，温度愈高，诱导效果愈好；温度较高时，处理浓度可适当降低，处理时间应相应缩短。梁倩倩[17]在西瓜四倍体诱导试验中发现，幼苗摘心后处理的温度越低，成活率越高，诱导率也越高，在29℃时幼苗的成活率和诱导率高于32℃和35℃；不同处理时段比较试验，以每天的17：00—18：00处理时存活率和诱变率最高，与8：00—9：00处理差异不显著，12：00—13：00处理时诱变率最低。木薯田间多倍体诱导陈显双[11]选择上午8：30—9：30进行药剂处理，而王建岭[12]则选择在傍晚进行处理。

3 多倍体的鉴定

染色体是遗传物质的载体。染色体数目的变化会导致形态、解剖、生理、生化等诸多遗传特性的变化。目前多倍体的鉴定方法可分为形态学鉴定、细胞学鉴定、流式细胞仪鉴定、染色体计数法鉴定、分子生物学鉴定、生理生化鉴定等。

形态学鉴定是初步鉴定多倍体的方法，多倍体植株与二倍体植株相比，一般表现出器官或组织具有巨大性；细胞学鉴定作为多倍体鉴定的辅助指标，通过显微镜观察叶片下表皮气孔的大小和密度、保卫细胞的长度和宽度、保卫细胞中叶绿体的数目等，以及花粉粒发芽孔数目等指标进行鉴定；流式细胞仪鉴定时通过测定染色剂染色的细胞荧光密度确定细胞内DNA含量，从而检测植株倍性的变化；染色体计数法鉴定是最直接和可靠的方法，冯斗、王超等[18-19]均对木薯根尖染色体的观察技术进行了研究和改良，张健、凡杰等[20-21]以木薯嫩叶为材料，对木薯叶片染色体制片技术进行了研究，取得了良好的分裂相效果；分子生物学鉴定是利用RAPD或RFLP等技术对多倍体倍性与来源等进行研究；生理生化鉴定是通过测定一些生理生化指标，比较其与对照之间的变化，从而为倍性鉴定提供参考，如测定持水量、叶绿素含量、果实含糖量、维生素含量、光合作用等。

多倍体鉴定一般采用多种鉴定方法相结合。张健[14]在多倍体鉴定时，先通过形态学和细胞学鉴定筛选变异植株，再将筛选到得植株继代培养后用染色体计数法对茎尖染色体数目进行鉴定，最后对鉴定为多倍体的植株，采用辅助鉴定测定叶片叶绿素含量以及叶片含水量。王建岭[12]在鉴定多倍体时，也分别采用了根尖染色体计数观察、外形比较鉴定、叶片下表皮气孔密度和气孔形态测定、叶绿素含量的测定和块根淀粉含量测定。陈显双[11]则应用了形态学观察和根尖染色体观察法进行鉴定。

4 嵌合体分离与多倍体植株稳定培养

嵌合体现象在植株化学诱变过程中普遍发生，而秋水仙素诱导多倍体时也广泛存在。嵌合体本身具有不稳定性，且多倍体细胞有可能不断被二倍体细胞所取代，朱雪云等[22]对植物嵌合体的类型和稳定性进行了探讨，并分析了扇形嵌合体、混合型嵌合体和周缘嵌合体的发生、转换、稳定与利用。在木薯多倍体诱导研究中，如何进行多倍体嵌合体的分离并将多倍体植株稳定培养是关键。

王建岭[12]在试验中虽然鉴定到染色体有加倍现象，但是几乎均为嵌合体，并且经继代培养后，变异株的表现基本与正常株无差异。

张健[14]在离体诱导木薯多倍体时，认为嵌合体分离程序可考虑对秋水仙素处理后的材料暂不进行筛选，而是在植株恢复生长后株高3～5 cm时，进行一次单芽茎段继代培养。继代后植株经形态学鉴定，将筛选到的变异株切段后通过茎段腋芽膨大培养3～5天，然后挑取芽点进行丛生芽增殖培养，再对诱导出的丛生芽进行切割分离。如此反复进行直到获得纯合率髙的木薯多倍体植株。但在嵌合体分离试验后是否获得木薯多倍体植株，以及多倍体植株特性方面的研究，没有后续报道。

陈显双[11]诱导木薯多倍体开始获得的也多为嵌合体植株，有相当部分开始能观察到变异，之后逐渐消失。其在试验中采用的分离方法是：先选择变异相分布较好且变异面积比较大的叶片，从其上方进行截杆，促进腋芽萌发，如此反复多次分离直到变异枝条上的叶片形态表现完全一致。该试验获得的变异枝条经过3～4代的无性繁殖后，后代体细胞遗传学特征表现为二倍、三倍和四倍并存的混倍体，且以四倍体细胞占优势。由此可见，该变异株很有可能是嵌合体植株。

5 问题与展望

5.1 木薯多倍体在国内应用较少

目前，在国内仅3～4个研究机构有开展木薯多倍体诱导方面的研究报道，并且均是采用秋水仙素诱导。根据资料显示，有关获得的多倍体植株表现情况的报道仅有2个：1980年的华南热带作物科学研究院（现中国热带农业科学院）培育出的木薯6068的四倍体植株，表现为抗叶斑病、生势壮、杆粗、叶厚、结薯集中、早熟，且产量、淀粉含量、总糖含量均比二倍体高[10]。2008年陈显双等[11]描述，获得的变异株3～4代无性繁殖后，其形态特征与对照相比，表现为叶片掌状裂片变短、变厚、颜色加深，植株生长稍慢，株型较紧湊。

5.2 木薯多倍体诱导可尝试新的诱变剂

秋水仙素目前在诱导加倍上应用最为广泛，但因为秋水仙素有剧毒，人们一直在尝试使用其他诱变剂进行替代。其中，已经发现的甲基氨草磷（APM）、戊炔草胺、安磺灵（Oryzalin）、氟乐灵（Trifluralin）等除草剂在诱导染色体加倍中具有很大的潜力，它们的作用机理和秋水仙素一样[23-24]。可以将这些新型诱变剂在木薯多倍体诱导中研究使用，并继续发掘更多使用安全、处理效果好的新型诱变剂。

5.3 对木薯嵌合体分离的时机把握和技术

嵌合体分离是木薯多倍体植株获得的关键技术之一，也是一大难题。掌握进行嵌合体分离的时机和分离技术可以提高多倍体植株取得的效率。

根据木薯组织材料的区别，多采用组织连续切割分离法、茎段多次继代分离法等，但目前还没有研究将木薯嵌合体类型、发生部位及分离方法与多倍体纯合度之间建立相关关系，将木薯分离或继代的次数与多倍体纯合度之间建立相关关系。这些研究的完善将使木薯嵌合体分离技术有重大突破。

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