SSR标记鉴定甜瓜品种‘红月亮’种子纯度

周志成 王惠林 王贤磊 李冠

摘 要： 为明确甜瓜品种‘红月亮F1代的种子纯度，通过提取甜瓜‘红月亮子叶DNA，利用SSR（Simple Sequence Repeats）分子标记对甜瓜品种红月亮F1代种子DNA进行了PCR扩增、检测与分析。结果表明，在20个SSR引物组合对亲本及F1代筛选中，共有6对引物组合具有多态性，多态率30%。选择CMBR026用于‘红月亮F1代种子纯度鉴定，使用该标记共检测118株，其中2株为自交株，种子纯度为98.3%；试验用的‘红月亮种子田间鉴定纯度为99.5%，鉴定结果一致。SSR分子标记方法更能准确鉴别出‘红月亮中的不纯株，且大大缩短纯度鉴定周期。

关键词： 甜瓜； 红月亮； SSR； 纯度鉴定

Genetic Purity Test of Melon Variety ‘Red Moon F1 Using SSR Marker

ZHOU Zhi-cheng1， WANG Hui-lin1，2， WANG Xian-lei2， Li Guan2

（1. College of Forestry and Horticulture， Xinjiang Agriculture University， Urumqi， Xinjiang 830052， China； 2. College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi， Xinjiang 830046， China）

Abstract： DNA of melon‘Red Moonand its parents was extracted from cotyledon and analyzed by SSR（Simple Sequence Repeats）markers. In 20 SSR primer combinations screened 6 primer combinations were polymorphic between parents，and the polymorphic rate was 30%. CMBR026 was selected for genetic purity. 118 seeds were tested using this marker，2 seeds were off-type. The same seed lot was also tested in the field and the purity was 99.5%. SSR molecular marker method can accurately test genetic purity of ‘Red Moonand greatly shorten time of the test.

Key words： Melon； Red Moon； SSR； Purity test

甜瓜是传统的特色水果和新疆主要的经济作物，培育高抗病的优良品种一直是广大育种工作者的目标。目前，我国生产中已广泛使用杂交品种[1]。种子纯度是种子质量的重要指标，近年来甜瓜生产中由于杂交种子纯度不达标，引起的种子纠纷时有发生，给农民造成一定的经济损失，对社会稳定造成不良影响[2]，因此为了保护种子经营及农民的利益，研究并建立每个品种快速、准确有效的种子纯度鉴定方法是非常重要的。目前鉴定甜瓜杂交种子纯度主要为2大类，一类是主要采用田间种植鉴定方法[3]，第2类就是利用目前的分子标记、生化等方法在实验室内进行种子真实性检测。田间植株性状鉴定需占用土地，费时费工，且北方生产的种子当年在北方无法实施田间鉴定，只能大棚鉴定[4]以及南繁鉴定[5]，更增加了生产成本。实验室检测主要为生化检测以及分子标记检测。生化检测中利用同工酶和蛋白质电泳，灵敏度高、较田间检测易操作等优点曾被大量应用于杂交种的检测中[6]。但同工酶位点和蛋白质种类有限，对于亲缘关系很近的杂交种难以区分[7]。DNA标记所检测的是作物基因组DNA水平的差异，因而非常稳定，能够稳定遗传[8]，可反映生物的个体和群体特征。随着分子标记技术的发展，越来越多的分子标记用于作物遗传作图，种质纯度的鉴定[3，9-10]。同时也有多种分子标记应用于甜瓜种子纯度的鉴定[11]。例如RAPD分子标记[12]，ISSR分子标记[13-14]，SSR分子标记[1]，SRAP分子标记[15]。

‘红月亮F1代甜瓜是2005年由新疆西域种业股份有限公司选育，该品种单果质量2 kg左右，果实为圆球形，果皮金黄色光滑，果肉橘黄色肉质脆，中心可溶性固形物含量14%～16%，口感品质优，植株易坐果，商品率高，耐低温弱光；适于设施保护地栽培；该品种在山东、海南等地试种推广市场反映表现较好，具有早熟、可溶性固形物含量高、品质口感好且外观美等特点。目前该品种F1代商品种子主要于秋季在海南采用田间种植鉴定，鉴定结果一般于次年1—2月完成；而设施生产上种子需求高峰期通常在每年的11—12月。为了适应生产需求，必须探索出适应设施生产要求的快速、准确的种子纯度鉴定方法。本试验探讨了采用SSR标记进行甜瓜品种‘红月亮F1代种子纯度鉴定的可行性及准确性。筛选SSR标记并对甜瓜品种‘红月亮F1代种子纯度进行鉴定与分析，与田间鉴定相比，SSR标记方法更能准确鉴别出‘红月亮中的不纯株，且大大缩短纯度鉴定周期。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为甜瓜品种‘红月亮F1代商品种及其亲本‘M627（母本）和‘M540（父本），杂交后代和亲本依据田间实验及室内实验需求，分别种植于国家瓜类工程中心和新疆大学生物工程研究中心。

1.2 方法

1.2.1 田间鉴定种子纯度 2012年在新疆昌吉国家瓜类工程技术研究中心试验田种植‘红月亮 F1代幼苗200株，通过观察植株与果实形态鉴定种子纯度。

1.2.2 实验室检验种子纯度 分为以下几个步骤。

1）DNA的提取 将供试材料分别于室内光照培养箱内进行播种育苗， 温度28 ℃，日照16 h。‘M627（母本）及‘M540（父本）20株，‘红月亮杂交后代商品种150株。待幼苗长出真叶时，从亲本中随机选择植株，混合叶片为材料，采用CTAB[16]法分别提取父本和母本的DNA。同时利用多样品组织研磨机Tissuelyser-24，采用CTAB法，分别提取150株‘红月亮DNA。

2）SSR标记PCR扩增 PCR扩增程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 复性30 s，72 ℃ 延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。反应的基本体系为：反应体系总体积为20 μL，含DNA 100 ng，dNTPs0.2 mmol·L-1，Mg2+ 1.5 mmol·L-1，上、下游引物各0.2 μmol·L-1，Taq DNA polymerase 1 U，10×PCRbuffer 2 μL，补足超纯水20 μL。

3）PCR扩增产物的检测 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测扩增引物。聚丙烯酰胺凝胶的组分为：总体积50 mL，含尿素21 g，超纯水17 mL，5×TBE 10 mL，19 ∶ 1丙烯酰胺7 mL，10% APS 225 μL，TEMD 50 μL。取4 μL扩增产物，加入4 μL Loading buffer（甘油含量为30%），进行电泳。电泳40 min后，将胶置于10% 的乙醇10 min，蒸馏水漂洗，置于1% HNO3 中浸泡6 min，蒸馏水漂洗，0.1% 的AgNO3浸泡10 min置于加入 3% 的Na2CO3和0.1% 的甲醛混合液显色3～6 min，用10%的冰乙酸2～3 min终止显色，蒸馏水漂洗空干。

4）多态SSR引物的筛选 从‘红月亮中选取20株DNA进行混合，与其父本母本DNA对照，在20对引物组合中筛选扩增带型清晰，有多态的SSR引物。其中条带清晰共显性的引物最适。SSR引物序列信息见表1，引物由华大基因合成。

5）‘红月亮种子纯度的鉴定 采用筛选出的最适SSR引物组合扩增全部‘红月亮F1代实验植株，扩增结果经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，分析鉴定种子纯度。种子纯度/%=（1-杂株个体数/F1个体总数）×100[15]。

2 结果与分析

2.1 田间鉴定种子纯度

田间种植鉴定‘红月亮F1代种子，经过田间观察F1代植株与果实性状多数表现一致，200株中只有1株与母本表型一致，因此田间鉴定纯度为99.5%。

2.2 实验室鉴定种子纯度

2.2.1 育苗 根据室内实验需求，将供试材料‘M627（母本），‘M540（父本）及‘红月亮F1代杂交种种植于培养箱中。温度28 ℃，日照16 h。待幼苗长出真叶开始提取材料的DNA。

2.2.2 多态SSR引物的筛选 应用20对SSR引物组合（表1）分别对‘M627（母本），‘M540（父本）及‘红月亮F1代进行PCR扩增分析。电泳检测结果显示，表现出多态性的SSR引物共有6对，分别为1号CMN22-22、3号MU9717、4号CMBR026、5号CMGA128、10号MU7194、14号CMBR139多态率达30%（图1）。

上述具有多态性的SSR引物可用于下一步的杂交种子纯度鉴定。其中PCR产物条带清晰且为共显性的SSR标记为最适引物， CMBR026扩增结果为：母本为扩增出低带，父本扩增出高带，F1代为双带。选择4号SSR标记CMBR026用于‘红月亮种子纯度鉴定。

2.2.3 ‘红月亮F1代种子纯度的鉴定 用SSR标记CMBR026扩增140株‘红月亮F1个体，进行F1种子纯度鉴定。PCR扩增获得约140 bp的PCR产物，进行经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳结果显示

（图2），泳道空的PCR未扩增出的个体，不计入有效结果。其中1号为母本，2号为父本，3号为纯的‘红月亮个体。箭头指示4号为母本基因型不纯个体，30号为父本条带，有可能是收种混入的掺杂个体。其余个体结果图未给出，也未进行数量统计。使用该标记检测共检测118株，2株不纯，种子纯度为 98.3%。

3 讨 论

种子纯度是种子质量的重要指标，对甜瓜作物产量及品质有直接影响。目前，甜瓜品种种子纯度的鉴定方法主要采用田间种植鉴定，凭借田间植株及果实的形态鉴定，进行早期鉴定比较困难[15]。以本研究中的供试材料‘红月亮种质鉴定结果一般于次年1—2月完成，而设施生产上种子需求高峰期通常在每年的11—12月，传统方法很难满足生产中的需求。其他作物如小麦、苦瓜、黄瓜等已经实现实验室完成种子纯度的鉴定[17-19]。分子标记在植物苗期就能进行检测。SSR分子标记是一种共显性标记，能够明显区别亲本与杂合个体，结果更为准确。同时，结合多通量DNA提取技术，能够实现大量快速完成甜瓜种质纯度的鉴定。

本研究首次使用SSR分子标记对‘M627（母本）和‘M540（父本）及杂交后代‘红月亮进行种子纯度的鉴定。研究中，‘红月亮个体数为140，其中有效个体数为118，占84.28%。通过SSR分子标记CMBR026对118株个体进行纯度鉴定，2株不纯，种子纯度为98.3%，不纯植株中纯合母本基因型1株，推测为杂交时母本去雄不彻底等原因造成，纯合父本1株，推测为种子机械掺杂造成。本研究中田间鉴定结果为纯度99.5%，与田间鉴定相比，SSR分子标记方法更能准确鉴别出‘红月亮中的不纯株，且大大缩短纯度鉴定周期。

本研究证明SSR分子标记能用于该品种的种子纯度鉴定，这为研究适应设施生产要求的快速、准确的种子纯度鉴定方法奠定了基础。然而在前期工作者的研究中发现，甜瓜杂交后代种质纯度鉴定由于不同品种的遗传背景不同，不同杂交后代的亲缘远近不同，单一的标记就无法实现准确鉴定纯度。这时对用于鉴定的标记需要进行筛选，也许会同时需要几个标记辅助鉴定。目前来看分子标记进行甜瓜种子纯度的检测是可行的，但推广到不同的品种还需要进一步研究，分子标记进行种质纯度的研究有广阔的研究前景。

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