SIN—1对小鼠肝原代细胞的影响

张海峰　王锋　孙艳宏

【摘要】目的：离体培养肝原代细胞并观察硝化应激重要硝化物质过氧亚硝基阴离子（ONOO-）供体SIN-1对肝原代细胞的作用。方法：酶消化法培养原代肝细胞。通过不同浓度ONOO-供体SIN-1作用于肝原代细胞24h，用MTT法分别检测各组肝细胞存活率，同时加入ONOO-清除剂FeTMPyP观察对细胞的影响。结果：200μM的SIN-1刺激24h使肝细胞存活率明显下降，加入清除剂后能够逆转这种现象。结论：SIN-1产生的ONOO-对原代肝细胞造成损伤。

【关键词】过氧亚硝基阴离子；肝原代细胞；MTT

【中图分类号】R329.24 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）01-0271-01

基金项目：内蒙古医科大学青年创新基金（YKD2013QNCX003）和博士启动资金

硝化应激（Nitrative Stress）指蛋白质的酪氨酸硝化，主要是由于机体内产生的一氧化氮（NO）或由NO衍生的活性氮与活性氧共同联合的生化作用，导致蛋白质中的酪氨酸残基硝化成3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，NT），从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态，该过程主要是通过硝化细胞内蛋白质、核酸等物质，引起细胞损伤或凋亡，这种对氮类的高应激性称为硝化应激[1]。随着肝脏疾病的研究的发展发现，硝化应激在多种肝脏疾病中起着重要的作用。硝化应激通常是机体内活性氧簇与活性氮簇同时升高共同作用产生的，而ONOO即是一种非常普遍的硝化剂，它可使蛋白质中的酪氨酸残基快速硝化成NT，从而使机体产生硝化应激，进而产生一系列的病理改变。目前的研究发现在一些肝脏疾病过程中或者病理情况下会导致肝脏发生硝化应激的现象[2]，但是对于硝化应激是否对肝细胞产生直接的作用以及其作用的具体机制尚不完全清楚。本项研究首先通过离体培养小鼠原代肝细胞后，采用ONOO-供体3-吗啉斯德酮亚胺（3-morpholinosydnonimine，SIN-1）体外直接作用于小鼠肝原代细胞，观察ONOO-对肝原代细胞的直接作用。

1材料和方法

1.1 实验动物

8周龄健康雄性C57小鼠，由内蒙古医科大学动物部提供。

1.2 主要试剂

主要试剂：噻唑蓝（MTT）和SIN-1均购自美国Sigma公司；5，10，15，20-四羟甲基（N-甲基-4‘-吡啶基）铁卟啉（FeTMPyP）购自美国Cayman Chemical公司。

1.3 实验方法

1.3.1小鼠肝原代细胞分离及培养：采用经典的两步灌流法[5]分离培养小鼠肝细胞。

1.3.2 MTT法检测肝细胞存活率：严格按照试剂盒说明操作。

1.4 统计学处理

数据以均数±标准差（X±s）表示，采用SPSS12.0软件进行统计学分析，各组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），LSD法进行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 小鼠肝原代细胞培养

首先采用经典的两步灌流法分离培养小鼠肝细胞，离心获得的肝细胞呈单个分散状态，相差显微镜下为具有一定立体感的圆形细胞。取所获得的肝细胞加入台盼蓝染色数秒后，至显微镜下进行活细胞计数，低倍镜下可见活细胞呈光亮圆形，透光度好，细胞核清晰，且不被台盼蓝着色；而死细胞壁皱缩，透光度差，可被台盼蓝染成蓝色。计数结果显示活细胞率大于85%。培养的小鼠原代肝细胞2h后开始贴壁，24h后80%的细胞贴壁。继续培养细胞形成岛状并连接成片，可见多个双核细胞

2.2 不同浓度SIN-1对肝原代细胞存活率的影响

随着SIN-1浓度的增加，细胞的存活率逐渐下降，当SIN-1浓度为500μM时能造成肝原代细胞存活率严重下降（见表1）。后续刺激细胞的浓度将选中有作用的中间作用浓度，即200μM浓度的SIN-1进行刺激，同时通过加入ONOO-清除剂FeTMPyP干预观察能抑制该现象（见表2）。除此之外，我们发现单独加入ONOO-清除剂时，对肝细胞存活率并无显著性影响。

3讨论

硝化应激参与了多种肝脏疾病的病理生理过程。有研究表明在酒精性肝病的发生发展过程中硝化应激參与了肝脏组织的损伤[3]，在体内发生氧化应激的同时，体内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达也明显升高，导致体内硝化应激的发生。体内多种途径可导致蛋白质酪氨酸残基的硝化，其中经由过量NO与.O2-反应生成的ONOO-介导的蛋白质硝化被认为是最主要的途径之一[4]。本研究观察了ONOO-供体SIN-1对原代培养的小鼠肝脏细胞的离体损伤作用。通过不同浓度的SIN-1产生不同浓度的ONOO-对原代肝细胞进行刺激，发现一定浓度的SIN-1能够降低肝细胞的存活率，说明在离体的情况下，硝化应激重要物质ONOO-能够造成肝原代细胞的损伤。本实验为临床上一些病理情况下由硝化应激产生的肝细胞损伤提供了间接证据，对于我们进一步研究硝化应激在各种病理情况下对肝细胞的具体作用机制由重要作用。

参考文献

[1].Rafael Radi.Nitric oxide，oxidants，and protein tyrosine nitration[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101（12）：4003-4008.

[2].林琳，周俊英.硝化应激在酒精性肝病中的作用.[J].国际内科学杂志2009，36（5）：264-267.

[3].周俊英，林琳，王玮.酒精性肝病大鼠模型肝组织中硝化应激.[J]指标表达增强基础医学与临床.2010，30（7）：773-774.

[4].El Assar M， Angulo J，Vallejo S，et al. Mechanisms involved in the aging-induced vascular dysfunction[J].Front Physiol，2012，132（3）：1-13.