山蒌单芽茎段培养与快繁技术研究

李新等

摘 要 以山蒌单芽茎段为外植体，对其进行组织培养和快速繁殖研究。结果表明：山蒌嫩茎最佳消毒方法为70%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒9 min；适合腋芽萌发的启动培养基为MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；继代增殖培养最适宜的培养基为MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；试管苗在1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA生根较好；山蒌试管苗移栽成活率可以达到95%以上。

关键词 山蒌；组织培养；快速繁殖；表面消毒

中图分类号 TS971 文献标识码 A

Abstract Tissue culture and rapid propagation of Piper sarmentosum were conducted with single-node stems as the explants. The results showed that the best surface sterilization was achieved by immersing the explants in the solution of 70% alcohol for 30 seconds then in 0.1% HgCl2 solution for 9 minutes. The medium（MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA）was suitable for starting culture of P. sarmentosum. Successful shoot proliferation was obtained on MS supplemented with 0.1 mg/L NAA and 3 mg/L 6-BA. The optimal rooting medium was 1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA.

Key words Piper Sarmentosum； Tissue culture； Rapid propagation； Surface sterilization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.026

山蒌（P. sarmentosum Roxb.）别名有山捞、假蒟、假蒌等，为胡椒科胡椒属植物。在中国海南、广东、广西、云南、福建等南部省区均有分布。山蒌叶面光亮有革质，有一种特异的香味。在海南黎族地区，人们常常用它的叶子来做菜，极具地方风味特色，著名的菜品有“黎家绿叶宝”、“山蒌叶肉碎煎蛋角”、“山蒌叶煎蛋”、“假蒌煎肉夹”、“鱼茶酿苦瓜”等，另外，山蒌叶还可用来爆炒、红烧、干煸、煲煮各色肉品，使菜肴口味醇厚浓香，深受食客欢迎[1-4]。据测定，山蒌叶的维生素、蛋白质、氨基酸和矿质元素营养含量丰富，尤其是山娄叶中钙、铁、锌、锰和锶的含量很高，属于超钙富钾、富锌超铁蔬菜，除具有独特的风味外，还具有良好的保健功能[5]。此外，山蒌具有一定的药用价值，可以全株、根、叶或果实入药。药性辛，温。温中散寒，祛风利湿，消肿止痛。用于胃肠寒痛、风寒咳嗽、水肿、疟疾、牙痛、脚气、痔疮、风湿性关节炎、疝气痛、风湿骨痛、跌打损伤[2]。因此，不论是作为热带特色的香菜，还是作为药用植物，其开发前景都十分广阔。

山蒌繁殖可以用扦插、压条、种子进行繁殖[6]，但常规繁殖方法使用的繁殖材料多，繁殖速度慢，不利于大规模推广种植。而采用组织培养方法进行繁殖，使用起始繁殖材料少，繁殖速度快，而且可以在一定的空间内实现工厂化生产，能在短期内满足大规模推广种植需要[7-8]。目前，对山蒌的组织培养研究尚未见有关报道。因此，本文利用山蒌单芽茎段通过丛生芽途径进行快繁，旨为山蒌的扩大种植和开发利用奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料取自海南大学（儋州校区）农学院苗圃基地以及海南大学（儋州校区）园艺园林学院实验基地。2012年7月取野外生长的山蒌进行室内盆栽，待嫩茎长出后取材；另于2013年3～7月连续晴天数天时，上午取材，选取生长旺盛、无病虫害的嫩茎。

1.2 方法

1.2.1 外植体的表面消毒与接种 将采集的山蒌嫩茎剪成长为3 cm左右的单芽茎段，清水浸泡10～20 min，然后转移到洗衣粉水中浸泡15 min，再用流水冲洗30 min后，放入含有多菌灵的溶液中浸泡30 min，再用流水冲洗1 h，用吸水纸虑干备消毒处理。消毒时先用70%酒精浸泡单芽茎段30 s，然后在转移到0.1%升汞溶液（滴有2～3滴吐温）中处理3～12 min。将消毒处理后的外植体用无菌水冲洗4～5次，用灭菌滤纸滤干后放在超净工作台上备用。接种时，在超净工作台上将单芽茎段修剪成1 cm左右，插入灭菌培养基。每个处理接种20瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次，于接种15 d后统计污染率、褐化率以及存活率，选择最佳消毒方式。污染率/%=污染的外植体个数/接种外植体总数×100；褐化率/%=未污染的褐变外植体个数/接种外植体总数×100；存活率/%=存活的外植体个数/接种外植体总数×100。

1.2.2 初代培养 初代培养使用的启动培养基为MS+0～0.5 mg/L NAA（1-naphthaleneacetic acid）+0～4 mg/L 6-BA（6-benzylaminopurine）。每个处理组合接种20瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复，30 d后统计萌芽率。萌芽率/%=产生芽的外植体数/总的接种外植体数×100。

1.2.3 继代培养 将初代培养生长出来的腋芽接种于附加0～0.2 mg/L NAA、0～4 mg/L 6-BA的MS培养基上，每个处理接种20瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复，20 d后统计增殖系数。增殖系数=继代增殖培养1个周期后产生的芽数/增殖培养前转接的芽数。

1.2.4 生根培养 将长至适当高度的苗芽接种于附加0～3 mg/L NAA、0～0.5 mg/L 6-BA的1/2 MS培养基上，每个处理接种20瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复，20 d后观察生根状况并统计生根率和平均生根长度。生根率/%=生根苗数/总的接种株数×100，平均根长（cm）=根总长/生根数。

1.2.5 培养条件 以上培养基均附加30 g/L蔗糖，6 g/L琼脂粉，pH值灭菌前调至5.8；培养基在灭菌锅里灭菌的温度、时间分别为121 ℃、30 min；培养室内温度控制在（25±1）℃，光照强度2 000～3 000 lx，光周期16 h/8 h（昼/夜）。

1.2.6 炼苗移栽 将生根发育良好的组培苗连同培养瓶移到室外遮阴棚中进行闭瓶炼苗10 d左右，然后将培养瓶的盖子打开，在自然光下进行开瓶炼苗5 d左右。试管苗移栽时用镊子小心取出，用无菌水冲洗根部附着的培养基成分，并用0.1%的高锰酸钾溶液清洗，把生根苗移栽到黏土：河沙（1 ∶ 1）基质中，然后进行常规管理。

1.3 统计处理

实验中所获得的各处理数据均先用反正弦函数代换，再进行方差分析，在p<0.05水平上，用Duncan法做多重比较[9-10]。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒

直接从野外采集外植体进行消毒，无论如何处理，污染率极高，几乎得不到无菌材料。采用室内盆栽植株的外植体进行消毒处理的结果见表1。未进行消毒处理的对照组，接种材料全部污染，褐化率和成活率均为0。随着消毒时间的增加，污染率由升汞消毒3 min的100%逐渐降低，到消毒12 min时只有8.3%；而褐化率在处理3～6 min时均为0，之后逐渐升高，消毒12 min时达到73.3%；而成活率也随消毒时间的增加而提高，在处理8（升汞消毒9 min）达到最高，显著高于其他处理，之后随着消毒时间的增加，成活率呈下降趋势。

2.2 初代培养

由表2可知，在相同NAA浓度的不同组处理中，萌芽率大体上随6-BA浓度的增加而增加。处理14，即MS培养基添加0.5 mg/L NAA和3 mg/L 6-BA处理所得的萌芽率最高，达到78.3%，显著高于其他处理。当6-BA浓度为0，NAA浓度为0.25 mg/L及0.5 mg/L时，处理所得萌芽率次低和最低，分别达11.7%和10%，显著低于其他处理。

2.3 继代培养

如同在初代培养中的情况，在相同NAA浓度的不同组处理中，继代增殖率随6-BA浓度的增加而增加。由表3可知，处理10（MS+0.1 mg/L NAA+4 mg/L 6-BA）的增殖系数为3.3，显著高于除处理9（MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA）外的其它处理。在NAA浓度为0.1 mg/L或0.2 mg/L但不附加6-BA的情况下，可能由于生长素NAA对增殖的抑制作用，未见增殖芽产生；而6-BA浓度达到4 mg/L时，基部产生的愈伤组织较严重，产生的苗也较弱（结果未显示）。综合来看，处理9的增殖效果较好。

2.5 生根培养

由表4可知，山蒌苗芽生根率在各NAA和6-BA浓度组合中随生长素NAA浓度的增加而增加，而且附加一定量的6-BA更有利于生根。处理15（1/2MS+3 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA）、14（1/2MS+3 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA）和处理16（1/2MS+3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA）的生根率分别为95%、83.3%和81.7%。统计分析结果表明，这3个处理差异不显著，但与其他处理的差异均达到显著。处理14的根长最长，除了与处理10、处理15以及处理16之间的差异不显著外，与其余各组处理之间的差异均显著。但各处理的生根数都只有1～2条。

炼苗移栽结果表明，山蒌试管苗移栽成活率可以达到95%以上。

3 讨论与结论

外植体的消毒处理是决定组织培养能否成功的关键因素之一。由于山蒌野生于高温阴湿的橡胶林下，从野生环境中采集的外植体不可避免地携带大量的外生菌和内生菌，内部污染是极难进行表面消毒的。本试验从野生环境中取材表面消毒几乎无法成功，这与同属的栽培胡椒组织培养中外植体的污染问题类似[11]。只有将野生植株移栽到洁净环境采集新长出的外植体，才获得成功。0.1%升汞溶液是一种强效灭菌剂，虽然随着消毒时间的延长，污染率会降低，但在杀灭外植体菌种的同时，亦可能对外植体本身产生伤害，导致外植体接种后出现褐化现象，并在某个处理时间之后降低成活率。这也是本试验中0.1%升汞消毒10 min以上处理反而使褐化率和成活率降低的原因。

利用山蒌单芽茎段进行启动和增殖培养中，6-BA发挥极其重要的作用，在相同NAA浓度的不同组处理中，萌芽率和增殖率大体上随6-BA浓度的增加而增加；在附加生长素NAA而不附加6-BA的情况下，增殖系数均为0。同时观察到，6-BA与NAA组合要比单独使用6-BA对启动和增殖培养的效果好。这与同属植物栽培胡椒的组织培养情况类似[12-13]。

由于胡椒属植物难以表面消毒（尤其是内源性污染）和容易褐化，胡椒属中不同物种的组织培养的难易程度具有物种和基因型的依赖性，因此，胡椒属植物仍然是目前较难组织培养的植物之一。在胡椒属植物茎尖和茎段培养方面，除刘进平等[12-13]对大叶种胡椒进行组织培养外，Mathew等[14]对胡椒的一个杂种Panniyr 1的无菌萌发实生苗茎尖进行了培养，在MS+1 mg/L IAA（3-indolylacetic acid）+1 mg/L 6-BA上实现丛生芽增殖；Philip等[15]对6年生的胡椒品种Panniyur-1、Karimunda和Arivalli大田苗的茎尖进行培养，在附加或不附加160 mg/L AdSO4的MS+1.5 mg/L 6-BA培养基上可增殖成芽。而Bhat等[16]在对胡椒属的3个种胡椒（P. nigrum）、P. betel和P. longum的根、叶、节和节间外植体的形态发生潜力进行了比较，发现P. colubrinum的反应最好，其次为P. betel和胡椒（P. nigrum），并且发现6-BA对芽的诱导优于KT（kinetin）。本文对胡椒属植物山蒌（P. sarmentosum）组织培养进行研究，利用室内萌芽抽条作外植体，有效克服了不能获得无菌培养的困难，同时，6-BA与NAA组合可实现丛生芽增殖。

本试验结果表明，山蒌幼嫩茎段最佳消毒方法为70%酒精消毒30 s后再用0.1%升汞溶液消毒9 min；启动培养基以MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA为宜；继代增殖培养最适宜的培养基为MS+ 0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；生根培养基采用1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA生根效果较好。利用本试验结果可成功地对山蒌进行组织培养和快速繁殖，这将为山蒌大规模推广种植打下种苗工厂化生产的技术基础。

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