转基因拟南芥中雌激素诱导的转录激活系统诱导条件的优化

胡晓龙等

摘要 [目的]探索雌激素诱导的转录激活系统（XVE）在拟南芥中高效表达外源蛋白的条件。[方法]构建XVEAtNFYA10：3×flag植物表达载体，转化拟南芥并获得了阳性植株；采用3种不同的诱导表达条件对外源蛋白的表达量进行检测。[结果]1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗外源融合蛋白表达量最高，进一步研究表明1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗在受诱导后8、16、24和32 h外源融合蛋白均有表达，在16 h时表达量达到最高，并持续到32 h。[结论]AtNFYA10：3×flag融合外源基因最优表达条件为1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗雌激素诱导16 h。

关键词 雌激素；转录激活系统；拟南芥；蛋白表达

中图分类号 S188；Q812 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03175-04

Abstract [Objective] To optimize the protein expression using an estrogeninduced transcriptional activation system. [Method] The plasmid XVEAtNFYA10：3×flag was constructed and transferred into Arabidopsis， and the positive plants were obtained. Three approaches were used to test the protein expression level. [Results] The data showed that the protein expression level came to a head in tenday old transgenic Arabidopsis on the 1/2 MS medium， and the protein was induced to express 8 hour later， and reach a peak from 16 hours to 32 hours. [Conclusion] The best condition for AtNFYA10：3×flag protein expression in Arabidopsis was tenday old Arabidopsis induced for 16 hours.

Key words Estrogen； Transcriptional activation system； Arabidopsis thaliana； Protein expression

目前已从动物、植物、病毒及微生物中分离到许多适用于植物基因工程的启动子。按照其作用方式和功能可分为3类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子驱动基因表达方式不受时间、部位、诱导物质的影响，在所有组织中都启动基因表达，在植物基因工程中得到了大量的研究和应用。如花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子[1]、水稻肌动蛋白基因（actin1）的启动子[2]和玉米泛素基因（ubiquitin）的启动子[3]等都是常用的启动强度很高的组成型启动子。由于不同物种之间有较大差异，不同来源的强启动子在异源系统中不一定都表现出强驱动能力。CaMV）35S启动子在烟草，拟南芥等双子叶植物系中都表现出非常高的启动活性，但是在大麦中则几乎没有启动活性[4]。另外由于其表达比较随机，常导致外源基因在植物的全部发育时期所有组织中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，加重了植物的合成与代谢负担，阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡[5]。组织特异性启动子调控的基因则只在某些特定的器官或组织部位表达，此类启动子克服了外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费，目前得到了广泛的研究与应用[6-7]。但是如果需要外源基因大量表达时，特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果。诱导性启动子，是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。与前面2类启动子相比，该类启动子可以快速有效地诱导转录基因的“开、关”，可根据需要诱导基因表达，这样就不会造成植物体内资源的浪费或者在诱导前期过量表达影响植物的生长发育。诱导型启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、激素诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子等[8]。

雌激素诱导的转录激活系统（XVE）包含2个控制目的基因表达的转录单元。第1个转录单元是强组成型启动子G1090控制的融合基因序列。该融合基因序列由细菌抑制子LexA（X）的DNA结合区、VP16（V）反式激活区和人雌激素受体（E） 的调节区组成[9]。第2个转录单元包括八个拷贝的LexA启动子序列、46 35S微型启动子[10]以及外源目的基因。在没有雌激素存在时，XVE融合蛋白的人雌激素受体（E） 的调节区与HSP90等胞内调节蛋白结合，作为单体定位在细胞质中，当有雌激素存在时，XVE融合蛋白的人雌激素受体（E） 的调节区结合雌激素，释放HSP90，并二聚化转运到核内，与外源目的基因上游8个拷贝的LexA启动子序列结合，激活目的基因的表达[11]。利用报告基因GFP的研究表明，该系统经雌激素诱导之后，GFP的表达水平比由CaMV 35S驱动的GFP高8倍[9]。XVE系统由于其较低的本底表达水平以及高效表达的特性得到了广泛的研究与应用[12]。但是不同的目的基因诱导表达效率可能不同，获得表达量最大的时间点也可能与GFP有差异。另外以往的研究仅限于对该系统诱导后目的基因转录水平的检测，对其翻译水平的检测鲜有报导。因此对于特定的目的基因在特定的转基因材料里利用该系统表达外源蛋白的最优化诱导条件的探索就显得很有必要。NFYA是一类结合CCAATbox的重要转录因子，包括3个亚基，NFYA、NFYB和NFYC[13]。在拟南芥中已鉴定了10个NFYA，13个NFYB和13个NFYC基因[14]。NFY家族在植物的生长发育及逆境反应中发挥了重要调控作用并受到miR169家族成员的调控[15-16]。实验室一直致力于miR169/NFYA 模块调控功能的研究，其中通过染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）方法鉴定NFYA调控的下游序列是一个重要环节， 能否获得大量表达的NFYA蛋白成为试验成败的关键，同时也为利用此系统表达其他蛋白建立一个技术体系。鉴于此，笔者以AtNFYA10为目的基因，构建由雌激素诱导的转录激活系统（XVE）调控其表达的植物表达载体，并转化拟南芥获得转基因植株，对拟南芥的培养方式、雌激素使用浓度、施用方法、不同处理时间点的表达量等因素进行系统摸索，获得一套适合于拟南芥中AtNFYA10高效诱导表达的方法，以期为今后其他同类基因的高效诱导表达及调控机制的解析提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。所用的野生型拟南芥为Col0生态型，大肠杆菌宿主菌为TOP10，农杆菌宿主菌为GV3101，均为实验室保存。

1.1.2 主要试剂。pER8flag载体，由研究室宗娜博士馈赠，在3个flag序列的5′端有xhoI和BstBI 酶切位点；pEASYT1 Cloning Vector，购自北京全式金生物技术有限公司；Taq DNA Polymerase，购自北京泽星生物科技有限公司；限制性内切酶，均购自NEB公司，T4 DNA连接酶，购自Promega公司；丽春红、Hygromycin B、PMSF和DTT，均购自Amresco公司；PVDF膜，购自MILLIPORE （Cat.No：ISEQ00010）；雌激素，购自Sigma公司（No.E8875，用DMSO溶解成10 mmol/L母液储存于-20 ℃备用）；Protease Inhibitor Cocktail Tablets，购自Roche公司（No.04693132001）；Monoclonal ANTIFLAG抗体，购自Sigma公司（No.F1804）；荧光二抗Goat antiMouse IR Dye，购自ODYSSEY公司（No.C2102401）；胶回收试剂盒，购自Axygen公司；引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。测序由北京博艾永华生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 AtNFYA10flag融合基因诱导表达载体的构建。根据拟南芥AtNFYA10基因的cDNA序列，设计引物YA10flagFW：5′CTCGAGATGCAAACTGAGGAGC3′和YA10flagRV：5′TTCGGATATATTAAGTTTGCAGC AGCC3′，下划线序列分别为xhoI和BstBI酶切位点。以cDNA作为模板，进行AtNFYA10基因CDS全长扩增。PCR产物亚克隆至pEASYT1载体，鉴定正确之后的质粒经xhoI和BstBI双酶切，与经同样双酶切的pER8flag载体连接，获得植物表达载体pER8AtNF10flag，表达载体转化至宿主菌TOP10，菌落PCR法筛选出含有目的基因的重组子提取质粒。质粒经xhoI和BstBI双酶切鉴定，挑选酶切鉴定正确的质粒送测序。挑选测序正确的质粒经电击法转至GV3101农杆菌感受态细胞，用PCR的方法来筛选阳性重组子。

1.2.2 转基因拟南芥株系的获得。运用蘸花法转化拟南芥[17]，收取T0代种子，并用25 mg/L Hygromycin B进行抗性筛选。具有抗性的转化苗再经PCR鉴定，获得至少3个独立转化的株系。收获T1代种子再经2次筛选获得T3代纯系，用于后续试验研究。

1.2.3 拟南芥植株的培养。 ①土培法。营养土与蛭石1∶1混匀后将拟南芥幼苗移栽到土中，14 h光照/10 h黑暗，24 ℃/22 ℃（白天/夜间）培养，光照强度250 mEinsteins/m2·s。②水培法。将拟南芥幼苗用Hoaglands营养液[18]水培，培养条件同上。③1/2MS培养基培养。将拟南芥种子用70%乙醇+0.05%Triton X100溶液浸泡振荡10 min后倒掉液体，再用95%乙醇清洗3次后用无水乙醇清洗1次，种子晾干后均匀播撒到1/2MS培养基上。置于24 h光照，24 ℃条件下培养，光照强度250 mEinsteins/m2·s。

1.2.4 雌激素诱导转基因拟南芥表达外源AtNFYA10：3×flag融合蛋白。①土培材料的诱导处理。取转基因拟南芥3个株系的T3代纯系种子为材料，土培生长1个月后，用50 μmol/L雌激素喷洒叶片进行诱导。取16 h处理的拟南芥叶片3～4片放入加了小钢珠的1.5 ml离心管中，液氮中迅速冷冻，于-70 ℃储存备用，进行后续的westernblot检测，每个试验做3次生物学重复。②水培材料的诱导处理。取转基因拟南芥3个株系的T3代纯系种子为材料，Hoaglands营养液水培生长1个月后，用50 μmol/L雌激素喷洒叶片，并在培养液中加入5 μmol/L雌激素进行诱导处理。取16 h处理的拟南芥叶片3～4片放入加了小钢珠的1.5 ml离心管中，液氮中迅速冷冻，于-70 ℃储存备用，进行后续的western-blot检测，每个试验进行3次生物学重复。③固体培养基培养材料的诱导处理。取转基因拟南芥3个株系的T3代纯系种子为材料，放入无抗1/2MS培养基生长10 d后，转移至加有5 μmol/L雌激素的1/2MS培养基继续培养诱导。取16 h处理的拟南芥幼苗3～4棵放入加了小钢珠的1.5 ml离心管中，液氮中迅速冷冻，于-70 ℃储存备用，进行后续的western-blot检测，每个试验进行3次生物学重复。然后对3个株系进行进一步处理并于0、8、16、24和32 h分别取样进行westernblot检测，每个试验同样进行3次生物学重复。

1.2.5 AtNFYA10：3×flag融合蛋白表达量的Westernblot检测。①植物总蛋白的提取。从-70 ℃冰箱中取出冻存材料，研磨至细末状，加入100 μl的蛋白提取缓冲液（50 mmol/LTrisHCl，pH 8.0；120 mmol/L NaCl；10% Glycerol；Triton X100；5 mmol/L PMSF；10 mmol/L DTT；1×Protease Inhibitor Cocktail），剧烈振荡十几秒钟，冰浴十几秒钟后继续振荡，反复多次直至混匀；4 ℃，14 000 r/min，离心15 min后于冰上吸取上清备用。②蛋白免疫印记（Western blot）。SDSPAGE胶的配置及样品处理、上样及转膜等步骤参照Handbook of Immunoblotting of Proteins [19]，待转膜结束，将PVDF膜取下，放入盛有丽春红溶液的培养皿中，染色1～2 min；清水洗涤2～3遍，用荧光照相系统（Chemi DOCIt Imaging System，UVP）照相，选取Rubisco的大亚基为上样对照；然后将PVDF膜放于用PBST配置的5%脱脂奶粉封闭液中，于摇床上室温封闭处理2 h，加入一抗（1∶5 000），4 ℃振荡过夜后PBST洗涤3次，每次5 min；加入二抗（1∶5 000），室温遮光60 min，TBST洗涤3次，每次5 min；最后用ODYSSEY荧光照相系统对PVDF膜扫描，获得目的蛋白的荧光条带。

1.2.6 Western blot数值分析。以Rubisco大亚基蛋白丽春红染色条带作为上样对照，用Image J软件对丽春红和荧光条带进行定量处理[20]，荧光条带值除以丽春红条带值所得数值即为样品所含目的蛋白的相对表达量，以此数值再进行进一步分析。

2 结果与分析

2.1 雌激素诱导表达AtNFYA10：3×flag拟南芥转基因植株的获得 利用农杆菌介导的方法转化拟南芥Col0花蕾，收获种子后播种于含有25 mg/L Hygromycin的1/2 MS培养基。培养1月左右，挑选抗性小苗转移到蛭石基质培养，待小苗长至5～6片叶时取叶提取基因组DNA进行PCR鉴定，鉴定阳性的植株收获T1代种子。图1为转化植株的PCR鉴定结果，所用引物为YA10flagFW：5′CTCGAGATGCAAACTGAGGAGC3′和PER8R：5′GAAACCGATGATACGGAC3′。共获得独立转化株系20个（图1）。随机取其中3个继续培养获得T3代纯系，以此为材料进行下一步的研究。

2.2 不同培养方式雌激素诱导外源AtNFYA：3×flag融合蛋白表达的分析 分别对3种培养方式培养的3个拟南

3 结论与讨论

试验研究表明，在1/2MS培养基中24 h光照连续培养10 d的转基因拟南芥幼苗，经5 μmol/L雌激素诱导培养至16 h，受转录激活系统XVE调控的NFYA10：3×flag融合蛋白表达量达到最高峰，然后略有下降后一直持续到32 h这个时间段都维持一个较稳定的状态。也对土培法生长一个月的转基因材料用50 μmol/L雌激素喷洒叶片的方式及水培法生长一个月的转基因材料用50 μmol/L雌激素喷洒叶片和5 μmol/L雌激素灌根的方式诱导后进行了试验。结果表明在培养基上生长10 d的幼苗对雌激素的应答最为敏感，外源基因的表达水平远远高于生长了1个月的拟南芥苗。因此选定1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗雌激素诱导16 h为最优的AtNFYA10：3×flag融合基因表达条件，为后续的试验工作的顺利进行提供了条件，也为利用此系统表达其他外源蛋白提供了一个参考。同时根据试验结果显示出采用雌激素诱导的转录激活系统的转基因拟南芥在不同的生长时期对于雌激素的诱导响应水平存在差异。这在研究文献中鲜有报道。其中的原因还有待进一步阐明。

利用雌激素诱导的转录激活系统（XVE）诱导外源基因在拟南芥以及西红柿转基因植株中大量表达在科学研究中得到广泛的研究与应用。但由于雌激素与植物内源雌激素形成共轭雌激素后会导致雌激素对该系统的诱导失效。所以该系统不适用于如大豆等内源雌激素水平高的植物物种中。另外由于雌激素大量使用会对环境产生污染以及雌激素受光照后不稳定[21]，此系统不适合应用于要进行田间实验的植物中。所以开发表达效率更高应用范围更广泛的诱导转录激活系统也显得很有必要。

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