α—硫辛酸诱导氧化应激下人视网膜色素上皮细胞表达血红素氧合酶—1

毛少伟 卿晨 邹桂花 罗甜 谭钢

【摘要】目的 观察仅α硫辛酸（ALA）对外源性H202诱导的人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞表达血红素氧合酶（HO-1）的影响，并探讨其可能的分子机制。方法 体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞，用12.5mmol/L外源性过氧化氢（H2O2）作用30min后，再加入不同浓度ALA作用不同时间。RT-PCR和Western blot分别检测HO-1 mRNA和蛋白的表达。荧光探针法观察ROS的产生。同时分别采用HO-1的激动剂CoPP和抑制剂ZnPP处理细胞，观察ROS的变化。结果 ALA处理ARPE-19细胞后，可显著诱导其表达HO-1 mRNA和蛋白，并呈一定的剂量依赖性。同时，H2O2处理后能显著诱导ARPE-19细胞产生ROS，而经不同浓度ALA处理后，ROS产生显著降低。结论 α-硫辛酸诱导氧化应激下人视网膜色素上皮细胞表达HO-1，从而抑制ROS的过度产生。

【关键词】α-硫辛酸；氧化应激；血红素氧合酶-1；活性氧

年龄相关性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration，AMD）是一种随年龄增长出现的双侧、进行性视网膜黄斑部退行性病变，是发达国家最常见的不可逆性致盲眼病，也是我国50岁以上人群中最重要的致盲性疾病之一。AMD的病理改变主要累及视网膜色素上皮（RPE）、感光细胞层和脉络膜界面。RPE细胞都是病变的中心环节之一，RPE具有很高氧化应激易感性。因而长期氧化应激导致的RPE细胞结构与功能异常被认为是引发AMD的重要原因。α硫辛酸（alpha lipoic acid，ALA）是一种理想的生物抗氧化剂，它广泛存在于自然界中，具有强大的抗氧化作（是维生素C的400倍），也是存在于线粒体内的辅酶，生物相容性和利用度很好[1]。本研究试图证实ALA对氧化应激下RPE细胞的保护作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂

荧光染料H2DCFDA购自Molecular Probes公司。H2O2、钴原卟啉 IX（CpPP），锡原卟啉IX（SnPP）为Sigma-Aldrich产品为Sigma产品。HO-1多克隆抗体购自Santa Cruz。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物。其余分析纯产品主要购自上海生物工程有限公司。

1.2 细胞培养与处理

ARPE-19细胞用含20%胎牛血清的低糖DMEM培养基于37℃，5% CO2条件下培养。实验分为正常对照组、H2O2处理组和ALA干预组。其中对照组仅加入等体积培养基。H2O2组细胞加入12.5mol/L H2O2培养30min；ALA不同浓度干预组：ARPE-19细胞经H2O2作用后，再加入10，20和30μmol/L ALA作用4h。

1.3 RT-PCR

采用Trizol提取RNA，并根据试剂盒提供的步骤进行RT-PCR。HO-1-mRNA 表达水平以β-actin 为内对照，逆转录参照TaKaRa 公司试剂盒说明书进行。阴性对照用每个样本直接行PCR，不加引物和摸板。扩增产物经琼脂凝胶电泳，紫外灯下照像，在图像分析系统上进行密度扫描，用HO-1 基因扩增产物的密度与β-actin基因扩增产物的密度比值表示HO-1的基因表达水平。

1.4 Western blot

根据试剂盒（江苏碧云天）提供的方案获取细胞总蛋白。收集蛋白后进行SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜上。随后用含0.1%吐温-20和5%脱脂奶粉的TBS封闭，孵育一抗、二抗，ECL显影。

1.5 ROS检测

以H2DCFDA为荧光探针检测细胞内ROS水平。其原理是不发荧光的H2DCFDA进入细胞后能被过氧化物、氢过氧化物等氧化分解为二氯荧光黄而产生荧光。孵育结束后，向各管中加入终浓度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min。PBS洗细胞3次，重悬细胞，荧光分光光度计检测细胞悬液荧光强度（激发波长485 nm，发射波长530 nm）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 15.0 统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差表示，多组比较采用one-way方差分析并行Students t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ALA对ARPE-19细胞mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，阴性对照组HO-1表达水平极低，H2O2处理后，HO-1仅有轻微增高。随着ALA剂量的增加，HO-1表达逐渐增多（图1）。

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图1. ALA对HO-1 mRNA表达的影响

1：Marker；2：阴性对照；3：H2O2；4：10μmol/L ALA；5：20μmol/L ALA；6：30μmol/L ALA2.2 ALA对ARPE-19细胞蛋白表达的影响

Western blot结果与RT-PCR类似，HO-1蛋白的表达水平随着ALA浓度的增加，而增高。内参β-actin在所有组中保持恒定（图2）。

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图2. ALA对HO-1 mRNA表达的影响

1：阴性对照；2：H2O2；3：10μmol/L ALA；4：20μmol/L ALA；5：30μmol/L ALA

2.2 ALA对H2O2诱导ARPE-19细胞产生ROS的影响

陰性对照组仅表达少量ROS，H2O2处理后ROS水平显著增高。ALA处理后，ROS的水平逐渐降低（图3）。

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图3. ALA对ARPE-19细胞产生ROS的影响

1：阴性对照；2：H2O2；3：10μmol/L ALA；4：20μmol/L ALA；5：30μmol/L ALA

3 讨论

ROS是指化学性质活泼、氧化能力强大的一类含氧物质，包括自由基、过氧化氢（H2O2）等；在生物体内，ROS是一种非常重要的生物信号传导介质，但ROS的异常增多可导致脂质的氧化、蛋白质的破碎、交联与聚集，同时还可导致DNA碱基的氧化。最终可造成细胞的功能障碍及死亡。视网膜是人体氧化反应最剧烈的组织之一，而黄斑区为了实现视觉的敏锐度，排列有极高密度的视锥细胞，而血供却极其有限，使得其更易成为氧化损伤的靶点。PRE细胞富含脂褐质、黑色素、黄素、细胞色素C等光敏色素，在持续的光照下特别容易积累光氧化损伤[2]。RPE对光感受器外节盘膜的吞噬也为其带来进一步的氧化應激负担。老年人的RPE细胞中的溶酶体吞噬能力和过氧化物酶的活性明显下降，因此衰老的RPE细胞更加容易受到氧化应激的损伤。ALA又被称为“全能抗氧化剂”，临床已被广泛用于治疗和预防心脏病、糖尿病等疾病，被证实对心肌细胞、胰腺B细胞，神经细胞等多种细胞具有保护作用。本研究发现，ALA处理后，可显著诱导HO-1表达。HO-1是血红素代谢的关键限速酶。研究表明HO-1 及其代谢产物在维护细胞稳态的过程中具有抗炎、抗增殖、抗氧化以及抗凋亡等作用[3]。例如，HO-1 表达的降低或缺失（药物性抑制作用或HO-1 基因敲除小鼠）使机体对氧化应激的耐受性降低，从而诱发广泛的氧化性损伤或器官衰竭，因此，ALA对AMD的保护作用可能通过上调HO-1表达而实现的。因为HO-1激动剂CoPP能进一步降低细胞内ROS水平，而其抑制剂ZnPP处理后则能逆转此过程。

综上所述，本研究初步证实ALA可能通过HO-1途径抑制H2O2刺激下ARPE-19细胞ROS的产生，从而促ROS的清除，最终阻止或者延AMD的发生。

资助项目：国家自然科学基金（81100648）

参考文献

[1]Rochette L， Ghibu S， Richard C， et al. Direct and indirect antioxidant properties of alpha-lipoic acid and therapeutic potential[J]. Mol Nutr Food Res， 2013，57（1）：114-125.

[2]Bertram KM， Baglole CJ， Phipps RP， et al. Molecular regulation of cigarette smoke induced-oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells： implications for age-related macular degeneration[J]. Am J Physiol Cell Physiol， 2009，297（5）：C1200-1210.

[3]Synowiec E， Szaflik J， Chmielewska M， et al. An association between polymorphism of the heme oxygenase-1 and -2 genes and age-related macular degeneration[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（3）：2081-2087.