地塞米松对成牙骨质细胞增殖和矿化功能的调节作用

陈瑾　兰泽栋　陈良娇　童晓洁

[摘要]目的：研究不同浓度地塞米松对成牙骨质细胞增殖、矿化能力的影响。方法：本研究设3个实验组和1个对照组，对体外培养的成牙骨质样细胞OCCM-30分别加入1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L的地塞米松作为实验组，对照组不加药。72h后提取细胞总RNA，用实时荧光定量PCR（Q-PCR）方法检测成牙骨质细胞矿化相关基因mRNA表达的变化。CCK-8法检测地塞米松对成牙骨质细胞增殖的影响，采用碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色对地塞米松作用后成牙骨质细胞生物学特性作初步观察。结果：地塞米松在高浓度时有抑制成牙骨质细胞增殖的作用。和对照组相比，实验组ALP活性增高，矿化结节形成明显增多，Q-PCR结果显示与细胞矿化相关基因 ALP、BSP、OCN、Runx-2 mRNA表达与对照组相比明显增高。结论：地塞米松可以增加成牙骨质细胞矿化功能，并可能由此影响牙根吸收和修复过程。

[关键词]成牙骨质细胞；地塞米松；牙根吸收与修复

[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）13-1071-05

牙周组织再生包括牙周膜、牙槽骨和牙骨质的再生。成牙骨质细胞是牙周组织中牙骨质形成重要的功能细胞，在牙根形成、牙周病牙骨质修复及牙根吸收与修复过程中起着关键性作用，其主要功能是形成牙骨质基质[1]。地塞米松是一种有效的类固醇骨刺激因素，它能够促进成骨细胞分化，促进骨生成[2-3]。成牙骨质细胞和成骨细胞同样作为矿化组织的分泌功能细胞，并且也有可能来源于同一前体细胞[4]，地塞米松是否在成牙骨质细胞分化中有着相似的功能和作用呢？本研究旨在探讨地塞米松对成牙骨质细胞粘附及矿化功能的影响，为临床牙骨质再生提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株：成牙骨质细胞株 OCCM-30由四川大学口腔医学实验中心馈赠。

1.1.2 实验试剂：地塞米松、茜素红、β-甘油磷酸钠，（Sigma，美国）；胎牛血清、α-MEM培养基（Gibco，美国）；Tripure，Q-PCR试剂盒（Roche，瑞士）；逆转录试剂盒（Fermentas，加拿大）；CCK-8试剂盒（南京凯基公司）；ALP试剂盒（南京建成公司）。

1.1.3 实验仪器：PCR仪（Bio-Rad，美国）；MX3000P荧光定量PCR扩增仪（Stratgene，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组和处理：将同步化生长的成牙骨质细胞随机分为4组。细胞以3×104/孔接种于6孔板中，24h后，分别加入1×10-5mol/L、1×10-6 mol/L、1×10-7mol/L的地塞米松，并设置空白对照组，隔日换液。

1.2.2 CCK-8法检测地塞米松对成牙骨质细胞活性的影响：将成牙骨质细胞按3×103个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后分别更换为含不同浓度地塞米松的α-MEM培养液，同时设不含地塞米松的空白对照组。继续培养24、48、72h后，各孔加入CCK-8溶液10μl，37℃下孵育2h，酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度值。

1.2.3 地塞米松对成牙骨质细胞矿化功能的影响

1.2.3.1 碱性磷酸酶（ALP）活性检测：在各组孔板中加入细胞裂解液覆盖满细胞，将细胞裂解后从中取30μl按照说明书操作在酶标仪520nm波长处测定各孔吸光度，同时测定其蛋白浓度，并按公式计算出ALP浓度。

1.2.3.2 矿化染色：成牙骨质细胞继续培养7天后，经4%多聚甲醛室温固定30 min、2%茜素红溶液（PH=8.3）染色30 min后，镜下观察矿化结节的形成情况。每孔加1.5ml 0.5N HCl含5% SDS溶液溶解着色的矿化结节30min后于405 mm波长酶标仪上测各孔吸光值。

1.2.3.3 Q-PCR检测成牙骨质细胞矿化相关基因的表达情况：将各组细胞培养3天后，收集样本，提取总RNA，RT-PCR试剂盒进行逆转录。将逆转录得到的cDNA在MX3000P实时荧光定量基因扩增仪上进行PCR扩增。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（见表1）。扩增条件如下：变性95 ℃10 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃20s共扩增40个循环数。收集数据，将各样本目的基因的阈值循环数（threshold cycle，Ct）值，与GAPDH基因的Ct值进行比较，得出待测样品的相对拷贝数。

1.3 统计学分析：应用SPSS l7.0统计学软件对所得实验数据进行单因素方差分析，并比较各组间差异，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地塞米松对成牙骨质细胞增殖活性的影响：CCK-8检测结果显示成牙骨质细胞在不同浓度地塞米松作用24h后，1×10-4mol/L、1×10-5mol/L组OD值有所降低且差异有统计学意义。作用48 h后，1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7 mol/L组OD值均小于对照组，尤以1×10-4mol/L组为甚，差异具有统计学意义。72h后，相比与对照组1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L组OD值均有所减小且以1×10-4mol/L组最为明显，细胞存活率仅为59.8%，差异具有统计学意义（如图1）。结果提示，低浓度的地塞米松对成牙骨质细胞活性的影响并不明显，而高浓度的地塞米松对成牙骨质细胞的活性具有抑制作用，且抑制率随时间的增加而增大。这种抑制作用在1×10-4mol/L组尤为明显。

2.2 地塞米松对成牙骨质细胞矿化功能的影响

2.2.1 不同浓度地塞米松对成牙骨质细胞ALP活性的影响：与对照组相比，各浓度地塞米松组作用72h后细胞内ALP活性均明显增高，且在1×10-7mol/L浓度组达到峰值，各组差异均具有统计学意义。提示地塞米松可能具有促进成牙骨质细胞矿化的作用（如图2）。

2.2.2 矿化结节形成：各组细胞培养8天后进行茜素红染色，实验结果显示，实验组与对照组相比，矿化结节的数量呈明显增多趋势，其中以1×10-7 mol/L浓度组增加最为明显（如图3～4）。

2.2.3 Q-PCR结果：Q-PCR分别检测了矿化相关基因ALP、BSP、OCN、Runx-2 mRNA的表达。结果显示，成牙骨质细胞ALP表达量与对照组相比显著增高，且在1×10-6mol/L组增高最为显著。BSP表达与对照组相比呈显著上调趋势，其中以1×10-5mol/L组最为显著，为对照组的6倍。OCN表达随地塞米松浓度的增加而明显升高，具有浓度依赖性。Runx-2各组表达量均明显高于对照组且差异具有统计学意义（见表2，如图5）。

3 讨论

成牙骨质细胞是牙体组织所特有的细胞，能分泌牙骨质基质并使之矿化，形成衬于牙根表面的牙骨质，在牙根的吸收和修复过程中发挥着重要作用。由于之前缺乏成熟的体外研究模型，对它的生物学性能研究相对较少。2000年，D'Errico等[5]采用含有受OCN启动子控制的SV40-TAg的转基因小鼠，成功培养出了永生化的成牙骨质细胞OCCM-30，并被认为是成熟的成牙骨质细胞系，相继展开相关研究。Hakki等[6]用50ng/ml的BMP-7作用于OCCM-30发现，BMP-7能够显著增加成牙骨质细胞相关矿化组织标志性基因BSP、OCN、OPN、Runx2的mRNA水平，并且能够显著提高成牙骨质细胞生物矿化的能力。因此本研究采用能够稳定培养的成牙骨质细胞株OCCM-30进行研究，观察其受到刺激后细胞内相关矿化组织标志性基因ALP、BSP、OCN、Runx2的mRNA水平变化。

地塞米松属于糖皮质激素，在体外实验中，地塞米松不仅可以诱导未分化的间充质细胞向成骨细胞分化[7]，并且能够促进人成骨细胞的增殖和分化[2]。Spiro等[8]在动物体内也发现地塞米松可增加BMP-7的生成，这些结果都表明地塞米松在体外或体内能够促进成骨细胞的分化。近年来，在地塞米松与成骨细胞分化关系的研究中，成骨细胞的作用得到了广泛、深入的讨论。Iu等[9]研究表明，地塞米松可以通过抑制细胞周期促进细胞的凋亡从而减少成骨细胞及骨细胞的数量，而这种抑制作用在成熟的成骨细胞系MC3T3-E1中表现的并不明显[10]。牙骨质作为体内独一无二的组织，它在某些方面与骨组织具有一定的相似性。本研究中，低浓度的地塞米松能够抑制成牙骨质细胞的增殖，但这种抑制作用并不十分明显，而在高浓度时，细胞增殖明显受到抑制，尤其以1×10-4mol/L组最为明显。这与文献中地塞米松能够使细胞的生长速度减慢的结论相一致，且证实了这种作用具有浓度依赖性。

碱性磷酸酶（Alkaline phosphotase，ALP）是成骨细胞及其分化的早期标志性酶，能水解有机磷酸盐释放出无机磷，并启动钙化进程。ALP的活性在一定程度上反映了细胞的成骨能力。本文在结果中证实了地塞米松作用于成牙骨质细胞后，成牙骨质细胞之间存在大量钙化结节且ALP活性和mRNA水平都明显增高。

骨涎蛋白（Bone sialoprotein，BSP）是一种非胶原蛋白，它在牙骨质发育形成初期呈高表达，扮演着十分重要的角色[11]。作为羟基磷灰石结晶成核的启动子，BSP参与着调控晶核的形成和生长，并具有诱导成牙骨质细胞分化和粘附的功能。Marom等人研究表明，BSP mRNA的表达在各个时期的矿化基质中均呈升高水平[12]。Hakki等[13]将1×10-7mol/L的地塞米松作用OCCM-30 6h和24h能够促进成牙骨质细胞BSP mRNA的表达，促进其矿化功能，而长时间（8天）的作用则会降低BSP的表达。这些研究结论在一定程度上和我们的实验结果相符合。在本研究中，地塞米松作用于成牙骨质细胞株OCCM-30 3天后BSP mRNA表达明显升高，其中1×10-5mol/L组约为对照组的6倍。这表明地塞米松能够提高BSP mRNA表达，促进成牙骨质细胞的矿化能力。

骨钙素（OCN）是成骨细胞合成分泌的一种非胶原蛋白，是反映成骨细胞分化成熟的指标， 能准确表示成骨细胞的活性。当骨形成和骨吸收偶联时，骨钙素是反映骨转换的指标；当骨形成和骨吸收解偶联时， 骨钙素是反映骨形成的特异性指标，它能准确反映成骨细胞的成骨功能。在本研究中，地塞米松作用于成牙骨质细胞3天时，各浓度组的OCN mRNA水平均明显升高，其结果与Hakki等[13]的实验相符。

Runt相关转录因子2（Runx-2）又称核心结合因子α1（Core bindingfactor α1，Cbfα1），是成骨细胞特异性转录因子，在成骨细胞分化和骨组织形成过程中起着重要作用[14]。研究证实，Runx-2可通过作用于已分化的成骨细胞，进而控制骨形成的速率[15]。Igarashi等[16]使用1×10-7mol/L地塞米松作用于大鼠头盖骨来源的原代培养的成骨细胞。证实地塞米松促进成骨细胞分化和矿化的作用可能是通过调节Runx-2的表达来实现的。在本研究中，地塞米松作用于成牙骨质细胞3天时，各浓度组Runx-2 mRNA水平均明显升高，同时矿化相关基因ALP、BSP、OCN等mRNA水平亦随之升高。我们也可以由此推断，地塞米松促进成牙骨细胞分化和矿化的作用也有可能是通过调节Runx-2的表达来实现的。

牙根的修复主要是牙骨质的再生，牙骨质对维持牙体组织的稳定和根部牙本质的功能具有重要的意义。本研究采用不同浓度的地塞米松作用成牙骨质细胞株OCCM-30，通过研究，证实了地塞米松能够促进成牙骨质细胞矿化功能，为其应用于临床牙根修复牙骨质再生提供了理论依据。

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[收稿日期]2014-04-30 [修回日期]2014-06-01

编辑/何志斌