基于GSN稳转肝癌细胞的转录组新基因研究

邓小芳　何敏　周怡等

摘要：目的 凝溶胶蛋白（Gelsolin， GSN）是凝溶胶蛋白超家族的成员之一，被发现对肿瘤转移具有促进作用。本研究旨在构建GSN双标签慢病毒载体，发现GSN过表达肝癌SMMC7721细胞转录组新基因。方法 PCR扩增GSN cds全长片段，接入带FLAG-HA双重标签的PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro慢病毒载体中，经测序鉴定的重组质粒，病毒包装后转染人肝癌细胞SMMC7721，嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系；In-Cell Western（ICW）检测GSN在SMMC7721肝癌细胞中的表达，Ion proton测序系统对转染及未转染的肝癌细胞进行mRNA测序。结果 测序表明重组质粒DNA序列与NCBI检索到的GSN编码序列一致；ICW检测到稳定转染细胞中GSN蛋白的表达为未处理细胞的2.02倍（P<0.05）；转录组测序共发现差异表达新基因21个，其中上调表达基因12个，下调表达基因9个，6个基因上调和4个基因下调的绝对表达值倍数变化均>4。结论 基于GSN稳定表达的SMMC7721肝癌细胞株所发现的转录新基因，为研究GSN在肝癌中的作用机制开拓新方向。

关键词：GSN；SMMC7721；慢病毒载体；转录组；新基因

GSN是一个钙离子和二磷酸磷脂酰肌醇依赖性肌动调节蛋白，主要有细胞质型和分泌型两个亚型，在细胞骨架重塑、免疫反应及磷酸肌醇信号通路中发挥重要作用[1]。研究表明GSN与引发细胞凋亡蛋白酶级联反应蛋白酶之一半胱天冬酶-3（CPP-32）作用，参与细胞凋亡[2]，同时对细胞生长和肿瘤转移也具有促进作用。本研究通过改造PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro慢病毒载体，构建人GSN稳定表达的SMMC7721肝癌细胞株，利用转录组测序技术进一步研究GSN过表达后对肝癌差异表达新基因的影响，为探讨GSN在肝癌中的作用机制奠定基础。

1资料与方法

1.1一般材料 肝癌细胞SMMC7721及293T细胞购于中国科学院上海细胞库，澳洲胎牛血清购于Bioind公司，RPMI 1640培养基及DMEM 高糖培养基购于Hyclone公司，GSN表达载体由上海桑尼生物科技有限公司测序，X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent购于Roche，基因组DNA提取试剂盒、质粒大提试剂盒为天根生化科技有限公司；GSN鼠抗人一抗、GAPDH兔抗人一抗购自美国Epitomics公司，IRDye 680标记、IRDye 800标记的二抗购于美国LI-COR公司，RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司，RNA 純化免疫磁珠试剂盒购于Life Technologies公司。转录组测序交Life Technologies公司完成。

1.2载体构建及细胞转染

1.2.1 PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体改装 用Xbal和BamH1酶切PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体，纯化回收后接入FLAG-HA tag，转化大肠杆菌DH5α后涂板，挑选阳性克隆，37℃过夜扩增后提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.2引物合成及GSN全长FLAG-HA双标签重组质粒构建 以人肝组织cDNA为模板，PCR扩增GSN cds全长片段，上游引物5′-gctccgcaccgccccgcgc-3′，下游引物5′-tggctgagctggctgcctga-3′，PCR 条件：94℃预变性3 min，94℃×20 S，54℃×20 S，72℃×40 S，共28个循环，72℃延伸10 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。用BamH1酶切改装的载体pCDH-CMV-FLAG-HA- EF1-Puro后接入GSN，构建出GSN全长的重组质粒，交上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.2.3病毒包装及肝癌细胞转染 前1 d 293 T 铺板，细胞60%～80% 汇合度，转染。将病毒质粒和包装质粒按照比例混合，然后依照转染试剂说明书操作。转染后继续培养，3 d后搜集细胞上清，2000 rpm，5 min离心，去掉残留在上清中的293 T 细胞，经0.45 um 滤头过滤，备用。如长期保存置于-80℃冰箱冻存。对数期生长的肝癌细胞SMMC7721前1 d铺板 ，长至60%～80% 汇合度，25 cm2培养瓶加入1 mL病毒上清、5 mL培养基，同时加入polybrene，至终浓度 8 μg/mL，感染后48 h，细胞1∶5 传代后，加入嘌呤霉素筛选稳转细胞株，鉴定表型。

1.3 ICW鉴定GSN表达 将培养瓶内转染及未转染的SMMC7721肝癌细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用全培养基稀释成1×105/mL细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μL，各做5个复孔，培养至细胞处于生长增殖期，状态佳。ICW实验过程参照Yuli Wan[3]等的研究。GSN一抗及GAPDH内参浓度分别为1∶100和1∶400，鼠、兔二抗浓度均为1∶5000。

1.4 Ion Proton转录组测序 转染及未转染的对数生长期SMMC7721肝癌细胞各两个75cm2培养瓶，进行总RNA提取，过程中注意避免RNA酶，测量OD值后确定样本浓度，混合总RNA，使两个样本的RNA含量均>100 μg，分离纯化mRNA，使其含量达5～400 ng，构建全转录组文库，制备模板后交Life Tech公司应用Ion Proton系统进行转录组测序。

1.5生物信息学分析 Proton Torrent服务器预加载了Torrent Suite软件，测序分析获得的数据自动传至Proton Torrent服务器，作覆盖分析、作图、变异识别等检测，Ion Reporter软件进行生物学功能注释和常见变异体的鉴定。对转录组测序数据进行数据覆盖度、对比信息统计，与GenBank中核酸序列进行同源性比较，差异片段无同源性>95%的基因，属新基因片段。

1.6统计学分析 实验数据采用SPSS 19.0统计学软件进行非参数检验Mann-Whitney Test分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1 GSN全长FLAG-HA双标签重组质粒的构建及鉴定 PCDH-CMV-MCS- EFl-Puro慢病毒载体经改装后，接入GSN全长片段構建成FLAG-HA-GSN重组质粒，测序鉴定质粒的核苷酸序列与预期符合，见图1，成功构建了GSN真核表达载体。

2.2 GSN稳定表达肝癌细胞株的ICW鉴定 Odyssey红外荧光扫描系统扫描GSN蛋白信号并定量，获得表达灰度值后，采用非参数检验Mann-Whitney Test分析结果，稳定转染细胞中GSN蛋白的表达为未处理细胞的2.02倍，两组的表达差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.3转录组测序检测mRNA水平的表达 测序结果以FPKM法计算基因表达量，样本间mRNA测序数据结果的差异比较，用读段的绝对表达值倍数变化（fold change）分析。测序数据分析表明GSN过表达载体转染细胞后，与未转染肝癌细胞相比，转录组测序结果发现差异表达新基因共21个，其中上调表达基因12个，下调表达基因9个，6个基因上调和4个基因下调的绝对表达值倍数变化均>4，见表1。

3讨论

随着功能基因研究的深入，细胞转染已成为常见的基本实验技术之一，而慢病毒转染凭其转染率高、转染稳定等优点，被广泛应用于细胞转染实验[4]。本研究通过对PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro慢病毒载体的改造，在载体中接入FLAG-HA标签，构建成GSN双标签重组质粒，转染肝癌细胞SMMC7721，并通过嘌呤霉素的筛选获得稳定表达GSN的肝癌细胞株。在稳定表达的肝癌细胞鉴定GSN的表达水平，采用新兴的ICW技术。ICW基于细胞培养板的原位目标蛋白定量，免去了蛋白提取、SDS-PAGE、转膜等多个实验流程，最大程度的避免了操作中的系统误差和人为误差，能客观的反应GSN蛋白在细胞内表达的真实情况，同时具有高通量、高灵敏度的特点。以未转染真核载体的SMMC7721肝癌细胞为对照，利用ICW验证转染前后GSN 的蛋白和mRNA水平的表达，结果表明，GSN蛋白水平在转染肝癌细胞中稳定表达上调，成功构建了GSN稳定转染肝癌细胞SMMC7721细胞株，为进一步研究GSN在肝癌中的调控作用机制奠定了研究基础。

在肝癌研究中，差异表达基因的筛选，可以为深人了解肝癌发生发展过程的机制研究提供理论依据，本研究在构建成GSN稳定上调表达细胞株的基础上，进一步利用Ion Proton转录组测序技术检测转染的肝癌细胞及未转染肝癌细胞mRNA差异表达。Ion Proton测序采用半导体技术，可以在短时间内以低费用得到高质量的mRNA定量测序结果[5]。此外，与基因芯片技术相比，RNA测序技术不需要用已知基因注释设计检测探针，因而能检测尚未注释的新基因，新基因的发现在疾病研究中具有十分重要的价值。本文充分利用RNA测序的优势，检测转染及未转染肝癌细胞的差异表达新基因。结果表明GSN过表达载体转染细胞后，与未转染肝癌细胞相比，转录组测序共发现差异表达新基因21个，其中上调表达基因12个，下调表达基因9个，尤其是6个基因上调和4个基因下调的绝对表达值倍数变化均>4，均可能为GSN在肝癌发生发展过程的调控基因。

近来的研究发现GSN在乳腺癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和口腔癌等多种人类肿瘤中低表达[6]，随着肿瘤病程的发展和肿瘤转移的出现，GSN的表达又呈逐渐上升趋势，有助于帮助临床判断病程和预后，并可作为潜在的肿瘤转移因子。虽然有报道认为GSN通过抑制p53基因的转录活性抑制了P53对肿瘤细胞凋亡的调节功能[7]，但GSN在肝癌发生发展过程中的作用还不清楚。本研究利用GSN稳定表达的SMMC7721肝癌细胞株所发现的转录新基因，为研究GSN在肝癌中的作用机制开拓新方向。

参考文献：

[1]Sadzynski A， Kurek K， Kononczuk T， et al. [Gelsolin - variety of structure and functions][J]. Postepy Hig Med Dosw （Online） ， 2010，64：303-9.

[2]Ohtsu M， Sakai N， Fujita H， et al. Inhibition of apoptosis by the actin-regulatory protein gelsolin[J]. Embo J ， 1997，16（15）：4650-6.

[3]Wan Y， Zhou Z， Yang Y， et al. Application of an In-Cell Western assay for measurement of influenza A virus replication[J]. J Virol Methods ， 2010，169（2）：359-64.

[4]Jiang J， Fan CY， Zeng BF. Experimental Construction of BMP2 and VEGF Gene Modified Tissue Engineering Bone in Vitro[J]. Int J Mol Sci ， 2011， 12（3）：1744-55.

[5]Boland JF， Chung CC， Roberson D， et al. The new sequencer on the block： comparison of Life Technology's Proton sequencer to an Illumina HiSeq for whole-exome sequencing[J]. Hum Genet， 2013.

[6]Baig RM， Mahjabeen I， Sabir M， et al. Mutational spectrum of Gelsolin and its down regulation is associated with breast cancer[J]. Dis Markers ， 2013，34（2）：71-80.

[7]An JH， Kim JW， Jang SM， et al. Gelsolin negatively regulates the activity of tumor suppressor p53 through their physical interaction in hepatocarcinoma HepG2 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun ， 2011，412（1）：44-9.

编辑/肖慧