慢性氟中毒诱发大鼠肝脏损伤机制的研究

蒙光义　王冬晓　王缉义等

摘要：目的 探讨氟化钠慢性中毒对大鼠肝脏生化功能的影响及其相关机理。方法 通过给大鼠自由饮用含有不同剂量氟化钠自来水3个月，制备慢性氟中毒模型，测定其血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性水平，同时检测各组大鼠肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽（GSH）的活力含量。结果 氟化钠慢性中毒各组尿氟和血氟含量均比正常对照组增高（P<0.01），并且中、高剂量组大鼠血清ALT、AST活性增高（P<0.01）；氟化钠各组大鼠肝脏MDA含量均显著高于正常对照组（P<0.01），S0D和T-AOC活性显著下降（P<0.01），同样中、高剂量组GSH含量活性显著下降（P<0.01）。结论 氟化钠慢性中毒能够引起肝脏损伤，氧化应激引起的氧化损伤作用可能是氟致大鼠肝损伤的重要原因之一。

关键词：氟化钠；慢性中毒；肝损伤；氧化应激；脂质过氧化；大鼠

长期以来，氟中毒主要损害牙齿、骨骼等骨性组织已十分明确，而对内脏的损害却未能引起临床学和病理学医生的重视。氟是机体重要的微量元素之一，但摄入过量能引起广泛的全身性病变，其作用机理至今尚不清楚。随着自由基医学的发展，人们越来越多的发现自由基与许多疾病的发生密切相关。研究表明，造成肝脏组织损伤是氟中毒引起的非骨相损害的重要靶器官之一，人群流行病学调查和动物实验均表明氟中毒可引起肝脏组织结构和功能异常[1]，其损伤机制目前尚不明确。大量研究结果表明，氧化应激在氟中毒对机体的损伤中起着重要作用[2，3]，机体慢性氟中毒时内脏组织病理损伤可能与氟诱导机体脂质过氧化作用增强有关[4]，但脂质过氧化在氟中毒肝脏损伤中的作用机制有待进一步研究。本实验通过制备大鼠氟化钠慢性中毒模型，检测氟中毒大鼠血清中谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性，并观察肝脏脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及总抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）含量的变化，进一步探讨肝损伤与脂质过氧化之间的关系，为深入研究氟中毒肝脏病变提供科学依据。

1 资料与方法

1.1实验动物 Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，体重（100±10）g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYKG桂2003-0005。动物室温度：（25±2）℃，相对湿度：（60±2）%。动物以广西医科大学医学实验动物中心配制的饲养。

1.2主要药品和试剂 氟化钠（北京化工厂生产，分析纯，批号：20090703）。谷丙转氨酶测定试剂盒（批号：20091114），谷草转氨酶测定试剂盒（批号：20091114），总抗氧化能力测定试剂盒（批号：20090918），丙二醛测定试剂盒（批号：20090918），超氧化物歧化酶测定试剂盒（批号：20090905），谷胱甘肽测定试剂盒（批号：20090905），考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（批号：20050723）测定，均为南京建成生物工程研究所产品。

1.3主要仪器 电热恒温水浴（北京长安科学仪器厂）；低温高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；722S分光光度计（南京建成生物工程研究所（北京长源实验设备厂）；漩涡混合器XW-80A（上海医科大学仪器厂）；电子天平（上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂）。

1.4动物分组 健康Wistar大鼠60只，隨机分为四组，每组15只，分别分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组电针治疗组。其中低、中、高剂量组大鼠分别自由饮用有含氟化钠55、110、222mg/L的煮沸冷却自来水，空白对照组大鼠自由饮用煮沸冷却自来水。给药期间称体重1次/2w，并观察一般状况，有无死亡等情况，实验周期共3个月。

1.5指标观察与测定 实验结束后收集24h尿，以待测定尿氟，各组摘除大鼠眼球取血，静置后3000r/min离心15min分离血清，采用采用氟离子选择电极法测定尿氟、血氟含量；同时按试剂盒说明，采用赖氏法测定血清ALT和AST活性。颈椎脱臼处死大鼠，取肝脏左叶剪碎后加入9倍生理盐水在冰浴中制成10%（W/V）肝匀浆组织液，3000r/min离心15min分离上清液，于-20℃保存待测。分别比色法测定肝组织中T-AOC活力、硫代巴比妥酸染色法测定MDA含量、黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性和二硫代双硝基苯甲酸法测定GSH含量，考马斯亮蓝法检测肝脏组织蛋白，均采用南京建成生物工程研究所产品试剂盒，严格按照均按照说明书操作测定。

1.6数据统计 统计计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析，所有数据均在计算机中由SPSS13.0统计软件处理。

2 结果

2.1一般状况 空白对照组和低剂量组大鼠活动正常，体重增长正常，毛色光泽；而中、高剂量组大鼠安静少动、体重体重增长率随染毒剂量增加呈降低趋势，饮水量偏多，部分大鼠毛色无光泽。空白对照组大鼠门牙呈棕黄色，表面色泽光滑；中、高剂量组所有大鼠门齿均有白垩，表面粗糙，光泽偏黄色，重者甚至发生牙齿缺损。实验期间，正常对照组雌性大鼠死亡1只；中剂量组雄性大鼠死亡2只；高剂量组雄性大鼠死亡3只，雌性大鼠死亡1只。

2.2氟化钠慢性中毒大鼠尿氟、血氟含量变化 实验结果显示，3个月后氟化钠各剂量组大鼠尿氟、血氟含量显著高于正常对照组（P<0.01），表明氟化钠慢性中毒模型建立成功。而且随着染氟剂量增加，尿氟和血氟含量也增高，具有剂量-反应关系，见表1。

2.3氟化钠慢性中毒大鼠血清转氨酶变化 实验结果显示，与正常对照组相比，氟化钠中、高剂量组大鼠AST、ALT活性水平显著升高（P<0.01），表明慢性中毒过程中氟化钠诱发大鼠肝脏损伤，见表2。

2.4氟化钠慢性中毒大鼠肝脏脂质过氧化的改变 实验结果显示，给予氟化钠3个月后，氟化钠各个剂量组大鼠肝脏中脂质过氧化产物MDA具有显著性增高（P<0.05、P<0.01），且与剂量的增加呈现一定的正比关系；而SOD和T-AOC随着氟化钠剂量的增加而显著性降低（P<0.05、P<0.01），表明机体抗氧化能力作用减弱。同样中、高剂量组GSH含量活性显著下降（P<0.01，P<0.05），见表3。

3 讨论

本实验采用含不同剂量氟化钠的煮沸冷却自来水喂饲大鼠3个月后，氟化钠各剂量组大鼠尿氟、血氟含量均显著高于正常对照组（P<0.01），表明成功地复制氟化钠慢性中毒大鼠模型。肝脏是机体的主要解毒器官，催化氨基转移作用的转氨酶在肝脏中含量丰富，当肝脏有损伤时，酶可以由损伤的细胞释放入血中，使血液中转氨酶活性显著增高。ALT、AST均为非特异性功能酶，正常时血清的含量很低，但当肝受损时，肝通透性增加，胞浆内的AST、ALT释放入血浆，致使血清AST、ALT的酶活性升高[5]。酶活性的高低变化与肝细胞受损的程度相一致，所以常作为肝功能检测的敏感指标，此外，二者均可导致微粒体钙泵活性降低，使胞质Ca2+含量升高，细胞内Ca2+稳态遭到破坏，从而引起细胞代谢紊乱甚至死亡。目前国内外有关氟与细胞凋亡的研究大多采用了流式细胞术方法，井铃等[6]应用流式细胞术发现加氟组大鼠肝脏凋亡百分率较对照组明显升高，证明了氟可导致大鼠肝细胞凋亡。本实验结果显示氟化钠中、高剂量组大鼠血清AST、ALT活性明显升高（P<0.01），说明氟中毒诱导了大鼠肝细胞凋亡，提示氟化钠慢性中毒能够诱發大鼠肝损伤，并且损伤程度与氟化钠剂量呈现一定的剂量关系。

目前，地氟病发病机理尚未能够明确阐明，氧化应激引起的自由基代谢紊乱损伤在地氟病中的一直是研究热点。在正常情况下，体内氧自由基的产生和清除是平衡的，当氧自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，体内氧自由基代谢就会出现失衡，或称氧化应激[7，8]。活性氧自由基可以与机体内多种生物分子发生反应，破坏正常组织的结构和功能，造成组织细胞生物膜、蛋白质、核酸等损伤。如氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，最终生成产物为MDA。因此，MDA的测定常常与SOD相互配合，MDA的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，保护细胞免受氧自由基损伤，通过SOD和MDA的结果分析就可以知道机体内氧化应激的情况。有研究报道自由基或其脂质过氧化产物易穿透核膜而直接损伤DNA，使凋控基因（P53、Bcl-2）等遭到破坏，干扰细胞生长和死亡的平衡，导致细胞发生凋亡[9]。本实验结果表明，本实验结果显示氟化钠各个剂量组与正常对照组相比MDA含量明显增高（P<0.01），而SOD活性显著降低（P<0.01），同样，T-AOC和GSH也均显著性下降，表明机体吸收过量的氟后肝脏组织过氧化作用增强，使机体处于氧化应激状态，抗氧化能力下降，造成机体氧化与抗氧化防御机制之间的失衡，这与相关文献报道相一致[1]。

本实验结果显示，机体摄入过量的氟后，体内自由基代谢紊乱，造成机体内过氧化作用增强和抗氧化能力降低，与肝损伤具有密切的相关性。同时也为证明氟中毒的自由基学说提供了有力的证据。总而言之，氟化钠慢性中毒能够引起肝脏损伤，氧化应激引起的自由基化损伤作用很可能是氟化钠致大鼠肝损伤的重要原因之一，本研究结果为预防和治疗地氟病患者提供了科学依据。

参考文献：

[1]郭晓英，孙贵范，孙宪民，等.氧化应激在亚慢性氟中毒大鼠肝脏损伤中的作用[J].中国公共卫生，2003，19（5）：575-576.

[2]郭晓英，陈爱莉，孙责范.氟对大鼠肝脏氧化应激及超微结构的影响[J].中国医科大学学报.2005， 34（4）：321-322.

[3]陈杨，于燕妮，吕学霞，等.氧化应激在燃煤污染型氟中毒大鼠中的作用[J].中国实用医药，2008，3（4）：1-3.

[4]Guan ZZ， Xiao KQ， Zeng XY， et al. Changed cellular membrane lipid composition and lipid peroxidation of kidney in rats with chronic fluorosis[J].Arch Toxiocl，2001，74（10）：602-608.

[5]时昭红，刘浩，刘嵩.银杏叶提取物抗大鼠肝纤维化中激活索A和肝细胞凋亡的作用[J].世界华人消化杂志，2006，14（21）：2060-2066.

[6]井玲，邵宗俊，任力群，等.氟中毒大鼠肝细胞凋亡研究[J].中国地方病学杂志，1999，18（2）：84-86.

[7]孙玉富.自由基与氧化应激及其在地方性氟中毒发病中的作用.中国地方病防治杂志，2003，18（1）：37-40.

[8]刘戎，魏凤辉，宣照林.自由基与氟中毒.中国地方病防治杂志，2003，18（6）：353-355.

[9]刘欣，刘先义.细胞凋亡与氧自由基[J].湖北民族学院学报.2002，19（4）：31-33.

编辑/哈涛