铃兰外植体愈伤组织培养与分化体系建立

李东林　李仁杰

摘要：铃兰（Convallaria majalis L.），属百合科铃兰属多年生宿根花卉，由于铃兰的种子采集困难，且分株繁殖系数低，利用再生离体培养技术可在短期内获得大量品质优良的植株，满足国内外市场需求。本研究用无菌嫩芽和根茎在MS培养基附加低浓度的激素诱导愈伤组织，经过分化和增殖培养获得无根苗，在含有适宜浓度激素水平生根培养基上使其生根，提高生根率。通过优化组合和重复试验，优选快繁体系，对铃兰种质资源的保护和开发利用具有一定的现实意义。

关键词：铃兰；外植体；愈伤组织；分化

中图分类号：S-3 文献标识码：A 文章编号：1672-4437（2014）03-0042-03

1 前言

铃兰（Convallaria majalis L.），属百合科铃兰属多年生宿根花卉，常生于东北、西北、华北地区针阔混交林林下或林缘灌丛中，是一种名贵的香料植物，它的花可以提取高级芳香精油，铃兰全草入药。铃兰有赏花，地植、盆栽、制香用、工业用之分，俏销国内外草坛。因其体内含有挥发性的芳香物质备受青睐。在绿化地被、净化空气、美化居室、给人以美的享受外，特别是在医药领域也作用非凡。

由于铃兰的种子采集困难，且分株繁殖系数低，我国至今无批量铃兰花卉供应，利用再生离体培养技术可在短期内获得大量品质优良的植株，满足国内外市场需求。有人曾对铃兰进行组织培养及繁殖技术进行研究，均未取得良好效果。本研究用无菌嫩芽和根茎在MS培养基附加低浓度的激素诱导愈伤组织，经过分化和增殖培养获得无根苗，在含有适宜浓度激素水平生根培养基上使其生根，提高生根率。基于上述生产需要和研究现状， 我们以百合鳞片为材料进行了组织培养和快繁，以期为百合种球生产提供依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

实验材料来源于室外林场阔叶林下野生铃兰（Convallaria majalis L.），外植体材料选择不同生长发育时期叶片、叶柄、花柄、芽、芽原基、根、茎等作为实验材料。

2.2 材料消毒

将采集的铃兰茎、幼叶等外植体材料用软毛刷先刷净上面的泥土后，用自来水冲洗6min左右，在超净台上用75%乙醇消毒30S，用0.1%升汞溶液消毒8min左右， 然后用无菌水冲洗数次，切成带有顶芽及无顶芽的2段， 约0.5cm×0.5cm， 叶片切成约1.0cm×l.0cm。

2.3 培养条件

不同外植体材料培养温度设置为22±3℃，相对湿度80%左右，连续光照12h/d，光照强度30～40umol.m-2.s-1，pH值6.0左右。

2.4 培养方法

把不同外植体接种在配制好的不同激素浓度培养基（MS）上培养（表1）。上述培养基中均加入蔗糖和琼脂的浓度分别为3.0%和0.7%。不同培养基诱导分化及培养实验重复2次，每种处理接种培养100个生长分化芽。

2.5 试管苗移栽与定植

当不定根长至3～4cm时，先在自然光照下炼苗4d，然后敞开瓶口再炼苗5d左右，用镊子从无菌瓶把再生苗取出，冲洗掉根部附着的培养基，栽入到由草炭：蛭石：沙（4：4：2）组成的复合基质中，前期注意避免强烈光照和保持环境湿润，待植株长出新根时可转入正常环境栽培管理。

3 结果与分析

3.1 不同培养基对铃兰外植体诱导及愈伤组织的形成

从表2中可以看出， 几种培养基接种不同铃兰外植体材料获得了不同的诱导和分化效果， S2 和S4两种培养基应用效果优于其它培养基， 这表明铃兰不同外植体愈伤组织形成及芽的分化对激素的种类和浓度有较大的适应， 这也正是我们实验中所期望达到的目的。

取实验材料铃兰幼嫩的根，置于S1培养基中，约4周后可见浅色坚硬的愈伤组织，继代培养至相同的培养基上，生长缓慢，转入分化培养基后未见有芽的分化。铃兰花柄作为外植体时，置于S5培养基中效果稍好，约30天后有浅黄色愈伤组织形成，继代培养至配制好的相同新鲜培养基上，在此期间更换几次新鲜培养基，愈伤组织慢慢生长，8周后形成黄色愈伤组织。将愈伤组织转至S3分化培养基后，也会出现芽的分化。

铃兰地下茎上芽，在S3培养基中培养4周后在基本有小芽的形成。把铃兰幼叶处理后置于S1培养基中，培养约1个月后开始有黄色颗粒状愈伤诱导组织，继续培养10周后再将愈伤组织转至S4培养基中进行分化培养，约60天左右愈伤组织出现绿色小芽的分化。

3.2 不同培养基对铃兰分化生根培养的影响

2.3 铃兰试管苗的移栽与定植的差异

本次培养试验移栽共成活686 株，成活率为87.6%。通过实验观察表明，铃兰试管苗容易移栽成活。即使移栽初期地上部已经死亡，再过1周左右，地下部的根茎也会萌发使其成活。定植后一个月， 统计证明成活了483 株，成活率为78.8%。定植的试管苗不仅保持了铃兰的生物学性状，而且后期生长旺盛整齐，但开花时间较正常栽培的延迟。

4 讨论

利用组织培养快繁技术生产铃兰优质种苗， 是一种有效的途径。有报道用铃兰种子进行无菌发芽组织的外植体进行培养。但是铃兰种子在自然生长发育情况下，当年秋播要经过2个低温阶段才可发芽，于第三年出苗，通过物理或化学处理措施处理后，也要6个月才能萌发，需要时间较长，所以，本实验直接以天然地下根状茎作为外植体材料，但由于根状茎生长在地下，需要长时间灭菌处理，为避免培养过程中的污染问题，可先将材料上泥土等附属物处理后，用自来水 冲洗干净，用纸吸干水分，浸入75%酒精消毒3分钟，再用0.1%汞溶液消毒一段时间，但仍有部分材料污染，部分材料在一定时间过后又有污染。

不同外植体的培养结果不同，本实验中采用的幼嫩花柄、芽和幼叶都较容易诱导出愈伤组织，并且有芽的分化，而用根进行外植体培养，只能诱导出愈伤组织，未获得芽的分化。因而外植体部位对于培养成功有较大影响。

不同部位外植体在诱导愈伤组织过程中，生长素2.4-D是不可缺少的，而不同部位对激动素的要求不同，

实际上铃兰植物许多部分的器官和组织都可用组织培养方法诱导成苗，本试验是以铃兰部分器官和组织为外植体进行组织培养，通过组织培养的方法快速繁殖，不仅减少了病毒重新感染的机会，而且通过外植体接种培养，进一步降低了基础苗中病毒的含量，使快繁得到的脱毒，种苗更健壮，以提高生长后应用价值。应用组织培养方法快速繁殖铃兰种苗虽然是较好的途径，但由于生产成本较高，技术要求严格，目前在实际应用中还有一定困难， 降低生产成本是把这一技术应用到生产中去的首要问题。

在试管苗的培养中，由于环境条件的变化，试管苗易发生变异。但在本研究中定植的试管苗保持了铃兰的生物学性状。研究以液体培养基取代琼脂固体培养基是否也会节省经费。这些措施使铃兰大量繁殖生产推广应用成为可能， 并为今后快繁技术的应用积累一定的经验。

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