低毒高效的植物石蜡切片方法

李凤英　马姜明　梁士楚　唐绍清　薛跃规

摘要：以乔木、灌木和藤本等不同类型植物叶及部分根茎为试验材料，对石蜡切片的主要技术环节进行了探究和改进。用天然有机溶剂松节油（oil ofturpentine）代替二甲苯（xylene）为透明与脱蜡剂，以阿拉伯树胶（gum acacia powder）为贴片剂，采用番红整体染色与固绿分片染色相结合进行双重染色。试验结果表明，该方法可避免二甲苯的毒性危害，减少环境污染，缩短试验所需的时间，提高劳动效率和制片质量。

关键词：石蜡切片；植物；低毒高效；方法

中图分类号：Q94-336

文献标志码：A

论文编号：2013-0773

0 引言

石蜡切片是植物显微技术上最重要最常用的一种方法，在植物解剖学及其相关领域的生产和科研中有着广泛应用。尤其是近年来，随着科学技术的发展与植物生态解剖学的兴起，石蜡切片技术重新活跃于植物科学研究领域，并成为了不同生境植物或演替系列优势种生态适应性研究的重要手段。但是，传统的石蜡切片方法不仅耗时长，而其常用的透明剂——二甲苯，气味奇臭难闻，是有机合成易挥发的可疑致癌物，毒性较大。二甲苯能够通过呼吸道和皮肤粘膜进入人体，损害神经和血液系统，对制片工作和人体健康构成了潜在的危险。加上石蜡切片程序复杂、步骤烦琐，不易切出满意的切片。因而石蜡切片技术的改进一直是学者关注和研究的重要问题之一。自20世纪50年代末以来，李正理教授曾多次修订出版了《植物制片学》、《植物制片技术》和《植物组织制片学》，为植物石蜡切片等奠定了技术基础。近年来，不少学者对植物石蜡切片技术进行了一些有益的探索和改进，如植物制片多重整体染色技术的研究、透明和脱蜡技术的改良、包埋和修蜡过程的改进，常规植物石蜡制片技术的改进，以及蕨类植物石蜡切片制作技术探讨等。但在低毒、快速的关键性技术问题上尚未见有大的突破或全面系统的报道，关于选用天然低毒有机溶剂为透明剂的研究鲜见报道。自2005年以来，结合科研工作和实践教学，以植物的根、茎、叶为主要试验材料，对传统植物石蜡切片的主要技术环节进行了探究和改进。优选无毒透明脱蜡剂、高效贴片剂，优化番红与固绿的对染方法，精简脱水、透明和浸蜡等试验操作流程。2012年在学校实验室项目的资助下，利用改进的石蜡切片技术对100余份包括乔木、灌木和藤本不同类型植物的叶组织材料进行了解剖观察，均达到安全、优质的效果。植物组织显微结构图像清晰，科研效果显著。笔者简明系统地介绍这一套低毒高效的植物石蜡切片方法，旨在为植物解剖学及其相关学科的应用研究与教学提供参考。

1 试剂的配制

1.1FAA固定液

将70%乙醇90mL、冰醋酸5mL、37%-40%甲醛（AR）5mL混合配成。

1.2阿拉伯树胶粘贴剂

在滴瓶中装入适量的蒸馏水，用解剖针挑取少量的阿拉伯树胶粉轻轻弹入瓶内，然后振摇，使阿拉伯树胶充分溶解；再挑取、弹入少量的阿拉伯树胶粉，再振摇，直至阿拉伯树胶不再溶解呈饱和状态，最后加入一小颗粒重铬酸钾作防腐用（液体略呈微黄色），一般可保存数月。

1.3番红和固绿染色剂

1.3.1番红染色剂 将1g番红溶于100mL的70%乙醇中即成。

1.3.2固绿染色剂 将0.5g固绿溶于100mL的95%乙醇中即成。

1.4封片剂

取一定数量的加拿大树胶或中性树胶于玻璃瓶中，用松节油为溶剂稀释。松节油的用量可用玻璃棒确定。当用玻璃棒粘取混合液时，玻璃棒一端的混合液呈小滴滴下而不呈丝状为宜。加拿大树胶置于阴暗处存贮，避免树胶变酸使切片变为棕黄色。

2 试验方法

2.1取材、固定与番红整体染色

选取正常生长植株的幼根、幼茎和向阳面成熟叶片。根、茎切成0.5-0.8cm长的小段，叶取中部沿叶脉两侧切成约0.4cm×0.8cm的小块，置于FAA溶液中固定48h，然后转到1%番红/70%乙醇染色液中整体染色5-7天。

石蜡切片取材要适中。根和茎选取直径为0.2cm左右大小为宜，直径较大的要对径切成小块。叶片最好选取新梢的成熟叶，太嫩的发育不完全，太老的中脉易碎。用FAA固定后的材料可长时间保存。

2.2脱水、透明和石蜡包埋

用1%番红/70%酒精整体染色的材料，可直接从85%乙醇开始逐级脱水，再用松节油透明。即85%-95%-无水乙醇-1：1无水乙醇与松节油混合液-松节油，每级1h，中间换液1次（即0.5h换液1次）。每次换液时，将液体缓缓倒出，用吸管吸去余液，并用卷筒纸擦干瓶口，尽量不让余液留至下级。

材料经松节油透明后，进行透蜡和包埋。首先，在换上松节油的材料瓶中加入少许碎石蜡，待其慢慢溶化后再加，直至其不再溶化呈饱和状态，如此在室温下或28-32℃的电热恒温培养箱中浸蜡1-2天。然后，移到40℃的电热恒温培养箱中，掀开瓶塞让松节油挥发，放置1h。尔后，把电热恒温培养箱温度升高至52℃，将材料轻轻移入盛有1：1松节油与石蜡（熔）的小杯中，放置1h。此后，将电热恒温培养箱温度调至65℃，同时在培养箱中放置2套纯石蜡小杯；把材料轻移到其中1套纯石蜡小杯中，放置1h后，再将材料轻移到另1套纯石蜡小杯中，再放置1h。在纯石蜡中透蜡2h即可包埋。

把先折好的纸盒放在温台上，将熔化的石蜡倒入写有标签的纸盒内，再用稍热的镊子把材料移入纸盒里、整理好，放置片刻。然后，轻轻提起纸盒两把手，将纸盒慢慢平放在冷水中，使熔蜡立刻凝固成蜡块。

2.3切片、脱蜡与固绿染色

将确定了切片方位的蜡块修正（上、下切面平行且为上小下大的梯形），固定在坚硬的小木块上。用切片机夹夹紧木块，使蜡块与刀口平行，然后进行切片。切片厚度以8-15μm为宜。选取好的蜡带分切成小段，先在洗净的载玻片上滴上阿拉伯树胶-重铬酸钾粘贴剂，再用摄子轻轻将蜡带贴在载玻片上，放于35-40℃的恒温水浴锅表面进行展片，用吸水纸吸去多余的水分，并用黑色签字笔写上标记（油性记号笔迹遇乙醇褪色，最好不用）。然后置于32-36℃的电热恒温培养箱中烘片24h，或自然风干。干燥后的切片用松节油脱蜡2遍，第1遍10-12min，第2遍5-8min，共15-20min。脱蜡完毕，即进入复水与固绿染色系列：1：1无水乙醇与松节油混合液-无水乙醇-0.5%固绿/95%乙醇染色液，每步停留2-3min。固绿染色停留时间最好镜检确定。即在染色1min时取出、放入95%乙醇中漂去浮色，在显微镜中观察着色效果而增减时间。经番红整体染色的材料红色较深，固绿染色时间稍长，可以获得很好的对染效果（图1）。

2.4脱水、透明与封片

固绿染色之后，再继续脱水和透明：95%乙醇-无水乙醇-1：1无水乙醇与松节油混合液-松节油（第1遍）-松节油（第2遍），每步约2-3min。最后用浓度适中的加拿大树胶或中性树胶封片，即在材料一边滴上封片剂，沿着一边轻轻盖上盖玻片。在载玻片上尚有松节油（未干）时进行封片，有利于封片剂扩散，少有气泡。制片完成，稍干即可在显微镜下观察和摄像。

3 讨论

科研和教学实践结果表明，采用该套改进的植物石蜡切片方法制片，用天然有机溶剂松节油代替二甲苯为透明与脱蜡剂，以阿拉伯树胶为贴片剂，采用番红整体染色、固绿分片染色有机相结合的优选双重染色方法，再加以精简和优化脱水、透明、透蜡等试验操作流程。可避免二甲苯的毒性危害，减少环境污染；提高了劳动效率和制片质量，大量缩短试验所需的时间。植物组织显微结构图像清晰（图1），科研效果显著。

3.1用松节油代替二甲苯为透明与脱蜡剂，以阿拉伯树胶为贴片剂，在试剂上优化

松节油为天然有机溶剂，安全无毒，价格低廉；溶于乙醇亦为石蜡溶剂，透明能力强。早在1843年，瓦利（Varlev）就用松节油作整体组织的透明剂，1853年克拉克开始用于脊髓切片材料封片前的透明。由此可见，松节油作透明剂已有悠久的历史。2005年笔者开始采用松节油代替常用的二甲苯为透明与脱蜡剂，2007年开始陆续在期刊上报道了应用这个改良方法的解剖试验结果，2012—2013年还在《广西动植物生态学研究》第二、三、四集发表了植物生态解剖学论文10余篇。长期的科研和教学实践证明，用松节油为透明与脱蜡剂，其透明和脱蜡效果均较好，操作安全便捷，且效果稳定可靠性强，没有二甲苯透明中容易发生的乳浊现象，还有效减少了有毒气体对人体的危害及环境污染。虽然松节油的脱蜡效果比二甲苯稍慢，但脱蜡重复2遍，多花5-8min即可达到理想的效果。松节油的脱蜡效果与杨虎彪等的试验结果相同。

阿拉伯树胶为贴片剂，操作简便快捷。其水溶液装片与贴片一举两得，且初学者较易掌握。

3.2番红整体染色和固绿分片染色相结合，在方法上优化

番红在常规的石蜡切片中要在脱蜡后“复水”才染色。染色液常用70%以下低浓度乙醇或水配制，材料在溶液中浸泡时间长、移动次数多，极易从载玻片上脱落。本方法改进在材料固定后直接进行番红整体染色，材料切片脱蜡后进行固绿染色。这样免去了复水和脱水“95%乙醇-85%乙醇-70%乙醇-1%番红/70%乙醇-70%乙醇-85%乙醇-95%乙醇”等一系列操作程序，大量减少了试验时间、移动次数和掉片现象，而且材料着色较深，分色效果显著，结构图像清晰。同时材料整体染色还有利于在包埋、切片和选片中辨认和操作。

3.3精简脱水、透明和透蜡等技术流程，在时间上优化

在传统石蜡切片中，其脱水、透明和透蜡等技术流程各级停留时间均在2h以上，尚具有可简化的操作空间。本方法改进为脱水、透明各级重复2遍，中间更换新溶液以保证试剂浓度，通常0.5h更换1次每级1h就可达到脱水或透明的效果。透蜡则改进为常温浸蜡，减少高温透蜡时间，提高试验效率，并使工作程序更易操作。