一例引起史氏鲟鱼创口感染的病原菌分离与鉴定

罗钦　罗土炎　饶秋华　涂杰峰

摘要：分离和鉴定引起史氏鲟鱼创口感染的病原菌，为史氏鲟鱼疾病防治提供科学依据。本实验分析了一例刚捕获的患有经微创手术后创口感染疾病的史氏鲟腐败肉和肝脏的细菌菌相，分离获得优势菌株YSJ01，对优势菌进行了形态学、药物敏感性试验、动物感染试验和VITEK全自动微生物分析系统鉴定。结果显示：菌株YSJ01为革兰氏阳性菌；VITEK全自动微生物系统鉴定菌株YSJ01为致病性嗜水气单胞菌；动物感染试验证明：史氏鲟经创伤感染后表现为创口溃烂的典型症状；药敏试验结果表明：菌株YSJ01对氟苯尼考、复方新诺明、大观霉素、利福平、强力霉素、卡那霉素等9种药物敏感。对青霉素、氨苄西林、羧苄青霉素、万古霉素、新生霉素、土霉素、萘啶酸、阿莫西林、林可霉素等表现出耐药性。本研究为南方史氏鲟鱼经微创手术后创口感染疾病的防治提供了重要的实验依据。

关键词：史氏鲟；嗜水气单胞菌；分离与鉴定

中图分类号：S941.42

文献标志码：A

论文编号：2013-0674

0 引言

史氏鲟是国家二级保护动物，由于外部特征不足以进行性别鉴别，因此人们通常采用穿刺技术进行鲟鱼性别鉴别，但是穿刺手术后鱼体留下了一条约1cm宽、5cm深的创口，鱼体局部免疫系统被打破，抵抗力下降，而且史氏鲟生活在水环境中，创口愈合一般比陆生动物慢，容易造成外科感染，引发鲟鱼慢性炎症甚至死亡，陈细华等利用外科手术对中华鲟进行性别鉴定时发生3尾死亡，由于死因不明，故也存在由于手术后造成死亡的可能，因此对创口感染病原菌的分离与鉴定，可为创口感染疾病的治疗和预防提供科学依据，防止鲟鱼创口感染疾病的发生和传染，从而降低企业养殖风险，对提高鲟鱼养殖业的成活率具有重要经济效益。伤口是病原菌的入口，霉菌侵入鱼体伤口引发水霉病已经在鲟鱼、黄颡鱼、鲤鱼、河豚、黄鳝、泥鳅等淡水鱼类和观赏鱼类中进行了大量的研究报道；刘振勇等2005年进行了溶藻酸弧菌病病原菌入侵大黄鱼伤口引发感染疾病的研究；马国文等1999年进行了嗜水气单胞菌入侵鲤鱼伤口引发感染疾病的研究，详细研究了病原与病理，是国内进行了嗜水气单胞菌对鱼体创口研究较深入的一篇论文。嗜水气单胞菌对史氏鲟鱼体创口感染的研究尚未见报道，史氏鲟属于冷水性鱼类，由于史氏鲟人工养殖主要在南方，南方夏季水温高可达30℃左右，而且持续时间长，导致史氏鲟自身免疫力下降，而嗜水气单胞菌是养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物常见的细菌性病原体，可通过受伤的皮肤及伤口感染，其生长繁殖最适的pH6.5-7.5、水温为30℃左右，因此史氏鲟经穿刺手术后创口极容易在高温季节受到嗜水气单胞菌的入侵从而引发感染疾病。2013年8月，福建省宁德市一史氏鲟鱼养殖场发现一尾经微创手术后创口感染疾病的史氏鲟鱼，该鱼的创口处具有明显溃疡的症状。因此本研究拟从患有创口感染疾病的史氏鲟腐败肉和肝脏分离出优势菌株，并对其进行了形态特征、药物敏感性试验、动物感染试验和VITEK全自动微生物分析系统鉴定等研究，以期确定该病的致病菌，从而为该病的治疗和预防提供科学依据。

1 材料与方法

1.1样品采集

1.1.1病料采样 将微创手术后创口感染的史氏鲟取出，立即放入冰水中浸浴5min进行冷休克，然后倒去冰水，将鱼至于层冰上，采用隔热泡沫箱保持鱼体温度在0-4℃，并于5h内运往实验室分析检验。

1.1.2健康鱼采样 活的低龄史氏鲟取自福建省某史氏鲟鱼养殖场，选择健康活鱼15尾，每尾重800-1200g，立即放入冰水中浸浴5min进行冷休克，然后倒去冰水，将鱼至于层冰上，采用隔热泡沫箱保持鱼体温度在0～4℃，并于5h内运往实验室水族箱养殖，进行人工感染试验。

1.2微生物取样

将患穿刺创口感染症状的史氏鲟用无菌水冲洗干净，置洁净托盘中，取创口一侧带溃疡的皮肤和肌肉，放入组织捣碎机搅碎，取25g于225mL无菌生理盐水中。

1.3试验方法

1.3.1病原分离及形态鉴定 取病鱼，用无菌生理盐水冲洗病鱼体表，在无菌条件下，用接种环分别挑取病鱼溃烂灶边缘的肌肉和肝脏接种于TSB肉汤；将接种后的TSB肉汤放入水浴振荡器中120r/min、30℃下培养24h后观察细菌生长状况，然后将带菌肉汤在应用琼脂固体培养基上划线培养，30℃下培养24h后肉眼观察菌落特征完全相同的菌落，并计数，数量最多的菌株作为优势菌，挑取形态特征一致的优势单菌落，划线LB平板进行纯培养。

1.3.2药敏试验 采用K-B纸片法。挑取单菌落，接种营养肉汤，28℃震荡培养24h，形成均一浑浊状。用生理盐水将菌液浓度稀释至1×10⁷-1×10⁸cfu/mL，均匀地将待检测的菌液涂布琼脂平板中，用无菌镊子贴上药敏片，30℃培养24h，观察其抑菌圈的有无及直径大小。根据抑菌圈直径判断标准判断菌株对药物的敏感性结果（抑菌圈越大表明敏感性越强），记录各药敏纸片的抑菌圈直径。

1.3.3动物感染试验 挑取营养琼脂固体培养基上的单个菌落接种于蛋白胨液体培养基中，摇床150min、30℃培养24h，将菌悬液稀释为3×10⁸cfu/mL。选择体表无伤痕、活力强的史氏鲟各五尾分为试验组和对照组，将鱼各置于2个水族箱中，充气饲养，日换水1次，早、晚各投喂1次配合饲料。暂养7天后，采用创伤感染，即将试验鱼体表划开一个口，穿刺，然后浸泡在细菌悬液中，对照组浸泡于无菌生理盐水中。每日定时投饵和换水并做好记录，再按照1.3.1的试验方法，进行细菌分离。以引起试验史氏鲟创口发生感染症状并能重新分离回收到原感染菌作为分离菌致病性的判定标准。

1.3.4生化鉴定试验 取纯化的菌悬液，稀释到一定的浊度，根据革兰氏染色结果，采用法国梅里埃公司生产的VITEK 2全自动生化分析仪进行细菌类型鉴定试验。

2 结果与分析

2.1分离菌培养及形态特性

经划线分离细菌后，在LB培养基上可得大量圆形、表面光滑、中央隆起、不透明、直径1.5mm、灰白色的优势生长菌落。将该菌命名为YSJ01。

2.2药敏试验

分离菌株YSJ01对18种药敏片的结果见表1。

由试验结果得知：菌株YSJ01对卡那霉素、强力霉素、氟苯尼考、大观霉素、链霉素、红霉素、氧氟沙星、复方新诺明、诺氟沙星等9种药物敏感。对林可霉素、青霉素、新生霉素、氨苄西林、土霉素、羧苄青霉素、阿莫西林、万古霉素、萘啶酸等9种药物不敏感，表现出耐药性。

2.3动物感染试验

通过创伤感染方式对健康史氏鲟鱼进行人工感染，结果发现：人工感染36h后开始逐渐出现创口溃疡症状，48h后创口变大而且溃烂严重，试验组病鱼表现典型的与自然发病一致的症状，而对照组一周内未见明显病症，活动正常。在无菌条件下，从人工感染发病的史氏鲟鱼病灶周围肌肉和肝脏中分离到YSJ01-R优势菌株，经细菌学鉴定，菌YSJ01-R和YSJ01菌的生物学特性一致为同一种。由于对照组正常，表明YSJ01菌株是史氏鲟鱼穿刺引起感染的致病菌病原。

2.4生化鉴定

本研究采用64孔的革兰阴性菌鉴定卡（GN），经VITEK2全自动生化分析仪检测后，检测结果见表3。仪器检测结果显示分离菌YSJ01为嗜水气单胞菌的概率为98%，达到了ID信息置信水平为极好水平，因此，综合各方面试验结果，可将分离菌YSJ01鉴定为嗜水气单胞菌。

3 结论

嗜水气单胞菌是史氏鲟鱼在福建省高水温季节经微创手术后引起感染的主要致病菌。史氏鲟鱼经过人工创伤感染本嗜水气单胞菌后，36h开始逐渐出现创口溃疡症状，48h创口变大而且溃烂严重，试验组病鱼表现典型的与自然发病一致的症状；本嗜水气单胞菌经过药敏试验后表明其对氟苯尼考、复方新诺明、大观霉素、利福平、强力霉素、卡那霉素等9种药物敏感；对青霉素、氨苄西林、羧苄青霉素、万古霉素、新生霉素、土霉素、萘啶酸、阿莫西林、林可霉素等表现出耐药性。本研究首次确定了在福建省高水温季节引起史氏鲟创口感染的病原菌是嗜水气单胞菌，而不是由冬春季节常见的霉菌或嗜盐性溶藻酸弧菌引起，这可能是由于嗜水气单胞菌为条件致病菌，本研究病料所在的福建省宁德市史氏鲟鱼养殖场，使用了大库容水库下游的淡水，当时的水温为30℃和pH7.5，这是嗜水气单胞菌生长繁殖最合适的水温和pH，从而导致史氏鲟创口被嗜水气单胞菌感染。

4 讨论

4.1本史氏鲟感染嗜水气单胞菌的原因

史氏鲟自身修复能力强，经外科微创手术后20天左右开始摄食，伤口完全愈合，因而由穿刺引起史氏鲟创口感染的研究未见报道。但本研究发现了一尾史氏鲟鱼，并经过病原菌的分离和鉴定后确定致病菌为嗜水气单胞菌，这可能是由于该史氏鲟体质比一般史氏鲟弱小，四龄鱼体重才2.5kg，而且当时养殖水体pH7.5，水温为30.0℃，在此条件时史氏鲟鱼自身免疫力下降严重，而嗜水气单胞菌却处于最适宜的生长繁殖环境中，由于同池中有发现头部严重溃烂的鲟鱼，经检测后发现头部溃烂的鲟鱼病原是嗜水气单胞菌，这与张玉贵等对杂交鲟体表溃疡病鉴定的病原一致，因此本史氏鲟可能是由于自身免疫力差，接触了头部溃烂的鲟鱼后，导致其伤口受到嗜水气单胞菌感染，引发溃疡。因此对于经过穿刺后的史氏鲟鱼，应与患有皮肤溃疡等疾病的鲟鱼隔离养殖，防止穿刺后的鲟鱼受到感染，特别是高水温季节更应注意。

4.2本史氏鲟未感染水酶菌的原因

本史氏鲟鱼养殖场位于福建省宁德市，养殖水为大库容水库下游的水，水温在冬春季节可维持在12℃～18℃之间，此时的水温容易引发水霉病，但是本史氏鲟鱼养殖场未发现经外科微创手术后创口感染的病料，这可能是由于史氏鲟鱼为冷水性鱼类，在低温季节其自身免疫力强，再加上鲟鱼场养殖技术人员拥有十几年的鲟鱼养殖经验，对常见的水霉病具有很好的防治方法，从而导致在冬春季节未出现病料，而在高水温季节，由于史氏鲟自身免疫力下降和嗜水气单胞菌防治技术不完善，会出现病料。

4.3本史氏鲟未感染溶藻酸弧菌的原因

溶藻酸弧菌属专性嗜盐性弧菌，主要存在于海水中，海产品的染菌率较高，而史氏鲟鱼属于淡水鱼类，为非海栖性的洄游鲟鱼，这与中华鲟不同，因而史氏鲟鱼在养殖过程中不需使用海水，从而不易受溶藻酸弧菌的感染。