内蒙古通辽地区蒙古族人群VEGF受体2基因与冠心病的关联研究

辛颖 奥乌力吉 王丽梅 赵丽

【摘 要】 目的 本研究拟在内蒙古通辽地区的蒙古族人群中验证血管内皮生长因子（VEGF）受体2（KDR）基因多态性与冠心病的关联。方法 研究对象为2010年1月至2011年10月通辽市疾病预防控制中心收集的400例样本，其中包括200例健康的蒙古族对照人群和200例蒙古族冠心病患者。采用PCR联合限制性内切酶消化的方法对目的基因进行分型，并通过抽样测序以验证PCR-酶切方法的准确性。ELISA方法检测血浆中KDR的水平。结果 KDR的3个SNP位點均与蒙古族冠心病的易感度相关，其中SNP-604的OR=1.45（P<0.05），SNP1192的OR=1.42（P<0.05），SNP1719的OR=1.49（P<0.05）。ELISA结果显示SNP-604CC基因型携带者血浆中KDR蛋白水平显著低于SNP-604TT基因型携带者。与对照组相比，冠心病组KDR蛋白水平表达增加，与CRP表达水平成正比。结论 KDR的SNP-604、SNP1192和SNP1719与蒙古族冠心病遗传易感性相关，其作用机制主要是通过调节KDR的表达去影响KDR与VEGF结合率。

【关键词】 KDR；变异；冠心病；蒙古族

【中图分类号】 R541.4 【文献标识码】 A

冠心病的发生是多种危险因素长期相互作用的共同结果。在冠心病的各个发病学说中，血管内皮细胞的功能失调几乎均有涉及，它被认为是冠心病发病进程中最重要的始动环节[1]。血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体系统在血管生成和内皮损伤修复过程中起到非常重要的作用[2]。KDR作为2型VEGF受体，主要表达于内皮细胞中，与VEGF结合后主要在血管的生成和修复中起关键作用。有研究显示，VEGF及KDR参与冠状动脉粥样硬化的全过程[3]。我们通过查找相关数据库，发现KDR基因上含有多个SNP位点，通过生物信息学提示得出某些SNP位点可能影响蛋白分子VEGFR2的表达情况及功能，即KDR的基因多态性可能与冠心病的发生与发展相关。我们选取KDR基因启动子区的多态性位点SNP-604以及编码区的多态性位点SNP1192和SNP1719，旨在研究这些SNP位点在蒙古族冠心病患者的个体遗传易感度。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 样本的入选 病例-对照人群样本来源于通辽市疾病预防控制中心在2010年1月至2011年10月收集的200例蒙古族冠心病患者和200例蒙古族健康对照。入选标准包括冠心病患者均通过冠状动脉造影检查确认，至少有一支冠状动脉狭窄大于50%。对照组人群的冠状动脉狭窄没有超过20%，并且没有其他的血管性疾病。

1.1.2 问卷调查和血标本采集 经过专业培训的工作人员对每一位冠心病患者和健康对照人群进行标准问卷调查，由本人或家庭成员接受问卷调查。问卷调查的内容主要包括被调查者的饮食、生活习惯（包括是否吸烟、饮酒等）、高血压史及服降压药史、神经疾病史、糖尿病史等。经过详细的体征测量后，取尿和空腹血，检测相关的生化指标。

1.2 基因测定 采用PCR联合限制性内切酶消化的方法检测各样本KDR的SNP位点。详细信息见表1。

1.3 ELISA方法检测血浆KDR蛋白水平 为了分析KDR基因的SNP-604位点对血浆KDR水平是否有影响，本研究随机选择24个健康对照的血浆，使用ELISA方法检测血浆中KDR蛋白的浓度。24个样本的基因型分别是8个TC，8个TT，8个CC。实验步骤按试剂盒的说明书进行操作。

1.4 统计学方法 所有数据由SPSS13.0软件统计，显著性水平P值定为0.05（双侧）。计量资料用平均值±标准差表示，采用独立样本t检验进行统计；计数资料用事件的比例表示，采用X2检验进行统计。利用卡方检验评价基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；计算所有SNPs的等位基因频率和基因型频率在病例组和对照组的分布，并进行每个SNP位点的单位点关联分析；采用多因素Logistic回归模型调整传统的心血管危险因素后分析不同基因型与冠心病的关联，并计算出调整后的相对危险度和95%可信区间。

2 结果

2.1 人群一般临床资料 病例-对照人群的主要临床资料如表2所示，在蒙古族的冠心病样本中患糖尿病、患高血压以及吸烟等指标均明显高于健康对照组（P<0.01）。

2.2 ELISA方法检测血清KDR蛋白水平 应用ELISA分析方法得出SNP-604CC基因型携带者血清中KDR蛋白水平显著低于SNP-604TT。结果见表3。

2.3 KDR基因的三个SNP位点的基因型频率与冠心病的关联分析 KDR的基因型频率分布见表4，均符合Hardy-Weinberg平衡。通过统计，我们发现KDR的3个SNP位点，当只携带一个危险等位基因型时，其发病风险显著高于不携带危险等位基因的人，但是与携带2个危险等位基因的纯合子相比，又无明显差异，提示目前存在着显性遗传效应。当采用显性模型来分析这3个SNP位点与蒙古族冠心病的关联时，我们发现在冠心病病例组中，所有这3个SNP的携带危险等位基因的纯合子基因型和杂合子基因型频率均显著高于正常对照组，利用多因素Logistic回归模型对年龄、性别、吸烟、饮酒等危险因素进行校正以后，这种相关性依然存在。

对SNP-604：M=T，m=C；对SNP1192：M=G，m=A；对SNP1719：M=T，m=A

3 讨论

病例-对照研究结果显示KDR基因3个SNP位点SNP-604、SNP1192、SNP1719均与蒙古族冠心病的遗传易感度相关。在校正一些传统的冠心病危险因素后，这3个SNP与蒙古族患冠心病的相关性依然存在，说明这3个SNP位点可以作为蒙古族冠心病独立的危险因素，即携带突变型等位基因的蒙古族具有更高的冠心病遗传易感性。

內皮细胞损害或者功能障碍可以导致冠心病的发生，体内异常血管的生成亦可增加冠心病的风险[4]。VEGF和KDR通过很多作用机制去参与影响冠心病的发病过程[5]。本研究中关于KDR基因的三个SNP位点，其基因型的频率分别与HapMap数据库中报道的数据一致。KDR基因SNP-604T>C可以下调KDR的mRNA水平，进而降低血清中KDR蛋白的水平。SNP1192G>A和SNP1719T>A位点均可以影响VEGF与KDR的结合效率，使其结合量少，结合效率低。通过本研究的实验结果，我们可以推测KDR功能活性的降低与血管功能障碍有关（如内皮细胞损伤、异常的血管修复等），可以促进动脉粥样硬化性疾病的发生和发展过程。

4 结论

KDR基因上的3个多态性位点SNP-604、SNP1192和SNP1719通过影响KDR的表达和功能，与蒙古族患冠心病的遗传易感度相关，这可作为内蒙古地区蒙古族冠心病新的遗传危险标记。

参考文献

[1] Gill M，Dias S，Hattori，et al.Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2 （+） AC133 （+） endothelial precursor cells[J].Circ Res，2001，88：167-174.

[2] Naghavi M，Libby P，Falk E，et al.From vulnerable plaque to vulnerable patient：a call for new definition and risk assessment strategies， part I[J].Circulation，2003，108：1664-1672.

[3] Barger AC，Beeuwkes R，Lainey LL，et al.Hypothesis：vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries.A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis[J].N Engl J Med，1984，310：175-177.

[4] Tenaglia AN，Peters KG，Sketch MH，et al.neovascularization in atherectomy specimens from patients with unstable angina： implications for patients with unstable anfina：implications for pathogenesis of unstable angina. Am Heart J，1998，135：10-14.

[5] Kuzuya M，Ramos MA，Kanda S，et al.VEGF protects against oxidized LDL toxicity to endothelial cells by an intracellular glutathione-dependent mechanism through the KDR receptor[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21：765-770.