1种适用于转基因玉米PCR检测的DNA快速提取方法

戴军　汪海　朱莉　黄大昉　郎志宏

摘要[目的]建立一种快速提取玉米基因组DNA的方法。[方法]对改良CTAB法进行进一步简化，不需要进行沉淀、洗涤、溶解和RNA消化等步骤，建立一种快速提取玉米基因组DNA的方法。[结果]该方法获得的DNA完整性及PCR扩增效果与试剂盒提取方法相比无明显差异；经过对样品ELISA检验可知，该方法得到的DNA用于PCR检测结果准确。[结论]该方法能够满足转基因玉米PCR检测中快速、高效、准确、高通量的要求。

关键词转基因玉米；基因组DNA；快速提取；PCR检测

中图分类号S513文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03494-03

基金项目转基因生物新品种培育重大专项（批准号：2013ZX08003-001）；国家自然科学基金（批准号：30970231）。

作者简介戴军（1986-），男，湖北十堰人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物学与基因工程。*通讯作者，研究员，从事植物基因工程研究。

玉米作为我国重要的粮食作物和工业原料，近年来需求不断上升，我国已从玉米净出口国转变成净进口国，玉米自给率不断下降[1]，粮食安全问题引起国人的注意。植物基因工程技术快速发展，为培育优质、高产、抗逆的玉米新品种，满足我国对玉米的需求，保证国家粮食安全提供了新方法[2]。在转基因玉米研究和培育过程中，阳性植株的筛选、插入序列分析、安全检测一般都离不开分子检测，最常用的分子检测手段是PCR检测。PCR检测的基础是提取满足检测需要的基因组DNA。目前，高质量的基因组DNA提取方法主要有CTAB法、SDS法、离心柱提取试剂盒法和磁珠提取试剂盒法[3-6]。但是前2种方法费时费力，后2种方法费用较高[7]，都难以适用于转基因植株检测时大批量提取基因组DNA的要求。在研究或者筛选群体较大（如转基因植株的大批量筛选、遗传规律分析等）时，提取基因组DNA就会成为一项繁重的工作，并成为检测和筛选速度的一个重要制约因素。因此出现了碱裂解法[8]和高温水煮法[9]等一步法提取DNA的方法。这些简易方法成本低、速度快，但是存在DNA提取质量差、PCR效果不理想和保存时间短等问题。

笔者通过对改良CTAB法进一步简化，摸索出经过2步处理得到用于PCR检测的基因组DNA提取方法（简称“2步CTAB法”）；同时比较了离心柱试剂盒提取法和2步CTAB法在DNA提取质量、耗费时间、成本和PCR扩增效果上的差异，并对PCR检测结果进行验证，以期为大批量检测PCR提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。材料为实验室获得的转Bt cry1Ah基因抗虫材料A1和A2事件及非转基因玉米自交系综31。

1.1.2主要试剂。CTAB提取液（ CTAB 4 g，NaCl 16.364 g，1 mol/L TrisHCl 20 ml（ pH8.0），0.5 mol/L EDTA 8 ml，先用70 ml ddH2O溶解，再定容至200 ml灭菌）、氯仿/异戊醇（24∶1）、2×Taq mix和植物基因组DNA提取试剂盒，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；ELISA试剂盒，购自EnviroLogix公司。

1.2方法

1.2.12步CTAB法提取玉米基因组DNA。①取50～100 mg的玉米叶片，放入1.5 ml EP管中。将EP管放入液氮中，等取完所有的样品后，用在液氮中快速冷冻过的玻璃棒将叶片研磨成粉末（大批量操作时可以在EP管中放入珠子，在自动磨样机上把样品砸碎）。加入500 μl CTAB提取液，在65 ℃水浴10 min。②在水浴后的EP管中加入500 μl 氯仿/异戊醇（24∶1），振荡混合，12 000 r/min离心5 min，取上清作为PCR模板。

1.2.2试剂盒法提取玉米基因组DNA。按照康为世纪公司《植物基因组DNA提取试剂盒使用说明书》进行操作，最后溶解在100 μl ddH2O中。

1.2.3提取的基因组DNA完整性分析。在提取的DNA中加入0.5 μl RNase（10 mg/ml），37 ℃消化30 min，取5 μl提取的DNA，加入1 μl 6×loading buffer，1%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成像仪上观察、成像。

1.2.4PCR检测效果分析。将提取的DNA稀释10倍，取1 μl为模板，外源基因cry1Ah的特异性引物F1：CGGATGGCAAATTGGAGGAG，R1：ACTTGAGGGAATGGCACGGGT，用于扩增A1事件的cry1Ah基因片段。F2：GCATCTCCACCTACACCGACTA，R2：CGGCTGGAATCTGGGTAATC用于特异性扩增A2事件的mcry1Ah基因片段。反应体系如下：基因组DNA（ l μg/μl）0.5 μl，5′ primer（10 pmol/μl）0.25 μl，3′ primer（10 pmol/μ1）0.25 μl，2×Taq mix 10 μl，ddH2O 9 μl。扩增条件如下：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增循环数30；最后72 ℃延伸2 min。

1.2.5对PCR检测结果的验证。按照CTAB 2步法提取转基因玉米A1和A2事件的基因组DNA，进行PCR检测。同时提取样品的总蛋白，用ELISA的方法进行对植株分离情况进行鉴定，ELISA的操作方法按照操作说明进行。

2结果与分析

2.1提取基因组DNA的完整性检测将2步CTAB法和试剂盒法2种方法提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶上电泳检测。图1表明，这2种方法提取的DNA电泳条带大小一致，未见有明显的差异，也未见明显的降解条带，说明2步CTAB法提取的基因组DNA具有较好的完整性。

2.32种提取方法的时间和成本比较对试剂盒提取法和2步CTAB提取法的成本和提取时间进行比较，分别以少量样品（以8个样品为例）和大量样品（以100个样品为例）2种情况。由表1可知，2步CTAB法的提取成本远低于试剂盒，提取所需要的时间也仅为试剂盒提取方法的1/4，在大批量操作时更具优势。

3结论与讨论

从1996年的170万hm2到2013年的1.75亿hm2，全球转基因作物的种植面积增加了100多倍，这使得转基因技术成为现代农业史上采用最为迅速的生物技术[10]。转基因技术作为一项高新技术，受到世界各国高度重视。“转基因生物新品种培育重大专项”的实施，也为我国发展转基因农作物研究提供了国家战略支撑[11]。玉米作为我国重要的粮食和工业原料，获得一批优质、高产、抗逆的转基因玉米是该“重大专项”的一个重要目标之一。

在转基因玉米转化筛选过程中，一般都需要进行大批量的PCR检测，以确定阳性植株。对获得的转基因材料的后代进行遗传规律分析时，也需要一个比较大的检测群体进行PCR检测。检测的前提是提取质量可靠、可用于PCR检测的基因组DNA，现已有的一些提取方法虽然得到的基因组DNA质量高，但提取步骤繁琐，成本高，费时费力，尤其是不适用于大批量的群体检测[12]。实验室在筛选转基因抗虫玉米的工作中摸索出一种适用于PCR检测的玉米基因组DNA快速提取方法，该方法在改良的CTAB法的基础上进行进一步简化，不需要沉淀、干燥、溶解、RNase消化等步骤，大大简化了操作过程，节省了操作时间。同时在CTAB的配方中不需要加入巯基乙醇，大大减少对人体的危害和对环境的污染。另外，简化操作步骤还可以减少对基因组的损伤，减小操作过程污染的可能性，减少PCR检测过程中出现的假阳性现象。经过和试剂盒提取法比较和应用ELISA的方法进行检验，发现其检测效果与试剂盒提取法无差异，准确度高，完全满足常规的PCR检测。实现了简捷、快速、高效、高通量提取玉米基因组DNA的要求。

参考文献

[1] 仇焕广，张世煌，杨军，等.中国玉米产业的发展趋势，面临的挑战与政策建议[J].中国农业科技导报，2013，15（1）：20-24.

[2] 彭永刚，张磊，朱祯.国内外转基因农作物研发进展[J].植物生理学报，2013，49（7）：611-614.

[3] STEWART JR C N，VIA L E.A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications[J].Biotechniques，1993，14（5）：748-750.

[4] EDWARDS K，JOHNSTONE C，THOMPSON C.A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis[J].Nucleic Acids Research，1991，19（6）：1349.

[5] 陈丽丽，张鹏，黄新，等.玉米基因组DNA提取及浓度测定方法评价[J].生物技术通报，2011（12）：13.

[6] 曹士亮，曹靖生，王成波，等.玉米 SSR 分子标记技术操作流程研究进展[J].中国农学通报，2012，28（15）：1-4.

[7] 楼巧君，陈亮，罗利军.三种水稻基因组DNA快速提取方法的比较[J].分子植物育种，2006，3（5）：749-752.

[8] 李筱婷，陈卓君，许文涛，等.一种适于 PCR 扩增的植物基因组DNA快速提取新方法[J].农业生物技术学报，2010，18（2）：394-399.

[9] 张晓祥，王玲，寿路路.一种快速提取小麦基因组DNA的改良 CTAB 方法[J].中国农学通报，2012，28（36）：46-49.

[10] JAMES CLIVE.ISAAA Report on Global Status of Biotech/GM Crops：2013[J].China Biotechnology，2014，34（1）：1-8.

[11] 黃大昉.加快发展现代农业，大力推进转基因生物育种产业化[J].中国农业科技导报，2007，9（3）：9-12.