毛霉型豆豉中总DNA提取的比较研究

钟燕　骞宇　李希宇　陈炼红　索化夷

摘要[目的]对毛霉型豆豉中总DNA的提取方法进行比较。[方法]选用常用的3种DNA提取方法（溶菌酶法、蛋白酶KCTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法和改良溶菌酶法）提取发酵豆豉中的总DNA，并测定总DNA的纯度，比较3种方法的优劣。[结果]通过琼脂糖凝胶电泳对提取效果进行观察比较发现，蛋白酶KCTAB法提取豆豉中微生物的宏基因组DNA的纯度最好，质量最高。[结论]蛋白酶KCTAB法更适合豆豉这类发酵食品宏基因组DNA粗提取，可以作为豆豉宏基因组学研究的基础。

关键词DNA提取；豆豉；微生物；PCR

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03499-03

基金项目国家自然科学基金青年科学基金项目（31201411）；西南大学博士基金项目（SWU112057）。

作者简介钟燕（1994- ），女，湖南郴州人，本科，专业：食品质量与安全。*通讯作者，副教授，博士，从事食品科学研究。

豆豉是我国汉族传统发酵豆制品，因其醇香浓郁，富于酯香，成品油润化渣，深受人们喜爱。在我国，豆豉除了供食用外，还有治疗疾病的效果，历代医书都有豆豉治疗疾病的记载，李时珍的《本草纲目》中则有“豆豉具开胃增食、消食化滞、发汗解表、除烦喘等疗效”的记载[1]。现代科学表明，豆豉还有很高的营养价值，含有丰富的蛋白质、糖，以及VB1，VB2和VE等[2]，同时含有多种功能成分，具有抗癌、溶解血栓、降血压、抗氧化和抗菌等生理功能[3]。

但是，毛霉型豆豉的生产采用传统自然发酵工艺，产品很难形成稳定的质量[4]。另外，传统发酵豆豉中的微生物区系复杂，大部分发酵豆豉中微生物起作用的机理仍需揭示[5]。对于豆豉微生物区系的研究是阐明豆豉成熟机制的重要组成部分，而现在主要采用非培养技术的方式进行研究[6-7]，豆豉DNA的高质量提取是这项技术研究的前提基础。

永川毛霉型豆豉是我国传统食品，因其健康美味、营养丰富深受广大消费者喜爱。但豆豉形成过程中的微生物作用机理研究较少，豆豉形成品质不稳定。传统发酵豆豉的微生物区系复杂，大多选择非培养技术进行研究，而提取高质量的DNA是非培养技术的前提条件。笔者通过对豆豉发酵的3种DNA提取方法的比较研究，寻求一种适合发酵食品稳定可靠的DNA提取方法，以期为豆豉微生物后续研究提供参考和依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。处于不同发酵阶段的永川毛霉型豆豉，为永川豆豉食品有限公司经天然制曲发酵，原料大豆产地为吉林省。

1.1.2主要仪器。MiniPROTEAN Tetro Cell核酸电泳系统，购自BioRAD公司；G：Box EF凝胶成像系统，购自Syngene公司；XW20A多功能食品加工机，购自鑫威电器有限公司；AIR TECH超净工作台，购自苏净安泰公司；LDZX40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器，购自上海申安医疗器械厂；LX100手掌型离心机，购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；GL88B渦旋混合器，购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；UV755B可见紫外分光光度计，购自上海分析仪器总厂；ZHWY211B恒温培养振荡器，购自上海智诚分析仪器有限公司；EDC810双槽PCR仪，购自东胜创新生物科技有限公司。

1.1.3主要试剂。氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、DNA染色剂等均为分析纯，均购自北京索莱宝科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、Marker、SDS、PEG、CTAB和TrisHcl，均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2方法

1.2.1永川豆豉生产工艺流程。大豆筛选→浸泡→沥干→常压蒸料→冷却→自然发酵制曲→翻曲→拌和（食盐含量15%、醪糟、白酒）→入罐发酵后熟→成品。

1.2.2溶菌酶法粗提取DNA[8-9]。参照熊开容从活性污泥中提取DNA的方法，改进后使用[10]。取豆豉样品5.000 g，在无菌条件下转移到15 ml的PBS（pH约7.0）中，搅拌后用4层纱布过滤，于30 ℃、120 r/min稀释振荡15 min，得到的溶液以2 000～3 000 r/min离心5 min，收集到的上清液再以14 000 r/min，4 ℃离心10 min；弃去上清液，用等体积的TES溶液洗涤1次，以14 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃去上清液。

沉淀加入1.5 ml溶菌酶溶液，混合物在37 ℃下 225 r/min振荡1 h；加入0.5 ml裂解缓冲液，0.5 ml磷酸盐缓冲液，0.5 ml氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）。离心管在漩涡混合器上3 000 r/min振荡10 min，得到的裂解液以6 000 r/min离心3 min，上清液转入另一离心管。向原管加入0.5 ml去离子水重新离心10 s，2 次离心的上清混合，9 000 r/min离心5 min，收集水相。水相加入0.6倍体积异丙醇沉淀1 h，12 000 r/min离心10 min；得到的沉淀以70%冰预冷的乙醇重复洗涤后风干，溶于500 ml TE缓冲液。取100 μl作DNA浓度测定或其他分析，其余的贮存于-20 ℃。

1.2.3蛋白酶KCTAB法粗提取DNA。取豆豉样品5.000 g，在无菌条件下转移到15 ml的PBS（ph 7.0）中，搅拌后用4层纱布过滤，30 ℃、120 r/min稀释振荡15 min。得到的溶液以2 000～3 000 r/min离心5 min，收集到的上清液再以14 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃去上清液，用等体积的TES溶液洗涤1次，以14 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃去上清液。

主要参照Zhou[11]的方法进行试验，沉淀加入1.0 ml DNA提取液混合，然后加入20 μl 10 mmol/L的Protein K，37 ℃水浴并振荡30 min，再加入150 μl SDS（20%），65 ℃水浴2 h，每20 min倒置1次；11 000 r/min 4 ℃离心分离5 min；将上清液转移到新的5 ml离心管，沉淀再加入0.5 ml提取液和50 μl 10%SDS；涡旋振荡后于65 ℃水浴10 min，11 000 r/min 4 ℃离心5 min，收集上清液合并于上次上清液。重复上述操作，3 次上清合并。上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1，V/V），颠倒混合；室温6 000 r/min离心5 min，吸取上清液转移至新的5 ml离心管中；水相加入0.6倍体积异丙醇沉淀1 h，于12 000 r/min离心10 min；沉淀以70%冰预冷的乙醇重复洗涤后风干，溶于500 μl TE缓冲液。取100 μl作DNA浓度测定或其他分析，其余的贮存-20 ℃。

1.2.4改良溶菌酶法粗提取DNA。主要依据张瑞福[12]、王建玲[13]从土壤微生物中提取DNA的方法，改进后使用。取5.000 g豆豉样品，在无菌条件下转移到15 ml的磷酸盐缓冲液中，振荡2～3 min后，于5 000 r/min离心5 min，弃去上清液，重复洗涤样品直至上清液基本清澈；再用15 ml磷酸盐缓冲液洗涤，小心转移洗涤液至另一离心管中；5 000 r/min再次离心5 min，弃去上清液。

取经预处理的豆豉样品，加入0.8 ml的溶菌酶溶液，5 μl蛋白酶K，混合物在37 ℃下200 r/min振荡1 h，然后加入经65 ℃预热过的0.3 ml裂解缓冲液、0.3 ml磷酸盐缓冲液和0.6 ml氯仿/异戊醇（24∶1，V/V），65 ℃水浴10 min，每隔2～3 min置漩涡振荡仪上振荡30 s，然后于5 000 r/min离心3 min，小心吸取上清转入另一2 ml离心管，加入0.6倍体积异丙醇冰浴沉淀30 min，于15 000 r/min离心10 min，弃去液相；沉淀以1.0 ml 75%冷乙醇轻微振荡洗涤，4 ℃下以13 000 r/min离心2 min，待乙醇彻底挥发后，加入500 μl TE缓冲液溶解DNA；取100 μl作DNA浓度测定或其他分析，其余的贮存-20 ℃。

1.2.5DNA的纯度测定。采用紫外分光光度计直接检测粗提取DNA的分光度，DNA的A260/A280值可以作为评价DNA纯度的一个指标。

1.2.6DNA的质量测定。用50×TAE溶液配制0.7%琼脂糖凝胶，使用Gold View核酸染料。吸取10 μl DNA溶液，加入1 μl的10×loading Buffer，混合均匀后依次加入点样孔中，然后吸取5 μl的λDNA/HindⅢ Marker加入一端的点样孔，在120 V恒定电压下进行电泳，电泳时间为50 min。电泳结束后在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照、分析。

2结果与分析

2.1图像分析图1表明，3种不同细胞裂解方法所提取的DNA在Marker条带的附近出线4条条带，而且提取的DNA条带完整性并不相同。根据图像来看，3号和4号条带的亮度强于溶菌酶和改良溶菌酶法的1号、2号、5号和6号的条带，其中3号模板的条带的亮度为最强，说明该法所提取的DNA得率为最高。

注：M为λDNA/HindⅢ Marker；1～2为溶菌酶法；3～4为蛋白酶KCTAB法；5～6为改良溶菌酶法。

2.2不同方法提取的DNA浓度比较A260/A280值在1.8～1.9的范围内说明DNA纯度很高，A260/A280小于1.8说明提取的DNA中含有一些蛋白质和多酚，A260/A280大于1.9说明提取的DNA中含有一些RNA；较纯净的核酸的A260/A230值大于2.0。另外，发酵豆豉中腐殖酸会影响A260吸光度，从而影响DNA纯度[14]。

由表1可知，3号和4号的A260/A280值接近1.9，A260/A230值接近2.0，说明3、4号样品的DNA纯度比较高，但有RNA污染；1号、2号的A260/A280值和A260/A230值都较低，说明1号和2号样品的DNA纯度没有3号和4号的高，有蛋白质或多酚等的污染；5号和6号的A260/A280值和A260/A230值比1号和2号的更低，说明5号和6号对应的样品DNA纯度很低。

2.33种提取方法的比较由表2可知，在DNA的提取得率上，蛋白酶KCTAB法优于溶菌酶法和改良后的溶菌酶法。提取后的DNA样品分装冻存在-20 ℃条件下1周后仍可以使用，基本无降解[15]。潘立等以曲霉菌为例，在蛋白酶KCTAB法的基础上建立了一种快速提取丝状真菌DNA的试验方法[18]。吴则东等通过对不同方法提取甜菜干种子的DNA进行比较研究，发现CTAB法比碱裂解法能提取出更高质量的DNA[16]。琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计显示，在试验使用的3种方法中，蛋白酶KCTAB法是提取豆豉中总DNA的最理想的方法。

3结论

综上所述，蛋白酶KCTAB法操作比较简单，琼脂糖凝胶电泳显示DNA得率和DNA质量都较高。比较溶菌酶法和改良溶菌酶法，蛋白酶KCTAB法更适合豆豉这类发酵食品宏基因组DNA粗提取，可以作为豆豉宏基因组学研究的基础。

参考文献

[1] 张佳琪，吕远平，谭敏.三种大豆发酵制品——豆豉纳豆及天贝的比较[J].食品工业科技，2012，33（9）：441-445.

[2] 穆慧玲，李里特.豆豉的保健功能及开发价值[J].农产品加工·学刊，2008（11）：31-32.

[3] 蒋立文.发酵豆豉的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2013（6）：1803-1809.

[4] 柯水国，朱广文.豆类发酵食品的研究进展[J].中小企业管理与科技（下旬刊），2013（5）：309-310.

[5] 杨福明，赵阳，侯静，等.传统大豆发酵食品及其工业化开发关键技术[J].中国调味品，2013（8）：18-21.

[6] 聶志强，韩玥，郑宇，等.宏基因组学技术分析传统食醋发酵过程微生物多样性[J].食品科学，2013（15）：198-203.

[7] 张彩凤，王婷婷，高小宽，等.宏基因组学技术及其应用概述[J].生物学教学，2013（3）：7-8.

[8] GAO P P，ZHAO L P.DNA extract ionfrom activated sludge for molecular community analysis[J].Acta Ecologica Sinica，2002，11（22）：2015-2019.

[9] 刘金英，汤斌.浓香型白酒窖泥中总DNA提取方法的研究[J].安徽工程大学学报，2013（3）：8-11.

[10] 熊开容，张智明，张敏.活性污泥DNA提取方法的研究[J].生物技术，2005，15（4）：43-45.

[11] ZHOU J Z，MARY A B，TIEDJE J M.DNA Recovery from Soils of Diversity Composition[J].Appl Environ Microbiol，1996，62（2）：316-322.

[12] 张瑞福，崔中利，曹慧，等.土壤微生物总DNA的提取和纯化[J].微生物学报，2003，43（2）：276.

[13] 王建玲，赵鹏程，邓弘毅，等.鱿鱼肌肉组织细菌基因组DNA提取方法的优化[J].浙江农业科学，2013（6）：737-740.

[14] CLAASSEN SHANTELLE，DU TOIT ELLOISE，KABA MAMADOU，et al.A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples[J].Journal of Microbiological Methods，2013，942：26-32.

[15] DONG B，YI J，DAI L L，et al.Evaluation of Several DNA Extraction Methods for Obtaining Total Community DNA from Anaerobic Digestion Sludge[J].Procedia Environmental Sciences，2013，18：15-18.

[16] 潘力，崔翠，王斌.一种用于 PCR 扩增的丝状真菌DNA快速提取方法[J].微生物学报，2010，37（3）：450-453.