冰醋酸法提取猪血红素的研究

胡睿琦 王建敏 王楠 于洋

摘要 [目的]合理利用动物血液，优化冰醋酸提取猪血红素的方法。[方法]试验以新鲜猪血为原料，采用冰醋酸法提取新鲜猪血中的血红素，考察冰醋酸的添加量、反应温度、反应时间、氯化钠添加量等因素对血红素提取的影响。[结果]试验表明，冰醋酸法提取猪血红素的最佳工艺为：冰醋酸添加量为血球4倍，氯化钠添加量为血球的2.4%，反应时间30 min，反应温度为95 ℃，此条件下提取的血红素含量为40.2%。[结论]研究可为猪血资源的合理开发利用提供理论依据。

关键词 血红素；冰醋酸法；提取

中图分类号 S879.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05211-03

动物血液总量一般为体重的5%～8%，其中含有20%的干物质，而蛋白质含量高达90%，是一巨大的蛋白资源。然而，我国许多屠宰场将牲畜屠宰后的血液主要用于制作菜肴、血粉、血罐头和血酱油等低附加值的产品，还有相当一部分的血液直接排入环境，这样既浪费了宝贵的蛋白质资源，又严重污染了环境。合理利用动物血液，可提高经济效益，减少环境污染，同时有益于人类身体健康[1-3]。从血液中提取的血红素是一种安全、稳定的天然色素，同时也是人类良好的补铁剂，现已逐渐用于食品行业的着色剂[4]。

当今工业上采用冰醋酸法提取血红素[5]，此法是俄国学者Schalteieff最早用于实验室提取、分离血红素的一种方法[6]，它是利用冰醋酸、氯化钠和血共热得到血红素结晶。利用冰醋酸从猪血球中提取血红素的方法中，国内外很少见到有关冰醋酸的添加量、反应温度、反应时间、氯化钠添加量等因素对血红素提取影响的报道。因此，筆者针对这些因素对提取血红素的影响进行探讨，为完善冰醋酸提取血红素的方法，开发猪血资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 新鲜猪血，锦州市肉联厂。主要试剂：柠檬酸钠（AR），天津市津北精细化工有限公司；氯化钠（AR），天津市凤船化学试剂科技有限公司；冰醋酸（AR），天津市凤船化学试剂科技有限公司；氢氧化钠（AR），沈阳市新化试剂厂；血红素标准品（BR），上海金穗生物科技有限公司。主要仪器：飞鸽牌TDL.5.A型离心机，上海安亭科学仪器厂；旋片式真空泵，上海挺威真空设备有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；101.3A101.3A型烘干箱，上海善志仪器设备有限公司；PHS.25型实验室pH计；BCD.160TXB型冰箱，北京博通跃科贸有限公司。

1.2 方法[7-9]

1.2.1 原料处理。向1 kg新鲜猪血中加入15%的柠檬酸三钠，添加量为血量的4%，充分混匀。取抗凝后的猪血，用离心机在3 600 r/min的条件下离心15 min，去除上层血清液，用浓度9%的生理盐水清洗后，在相同条件下离心，过100目筛，除上清液，将下层血球置于容器中，并于0～4 ℃保存备用。

1.2.2 血红素提取。向锥形瓶中分别加入一定量的冰醋酸与溶解的氯化钠溶液，小心加入10 g猪血球，再连接冷凝管，分别在一定温度下反应一段时间后，停止加热，冷却至室温，放置过夜。用真空泵连接布氏漏斗进行抽滤。抽滤后，置于110 ℃烘干箱内干燥至恒重，并研成细粉，得血红素粗品。工艺流程如下：原料→抗凝血处理→离心→血球→提取→提取液→沉淀→抽滤→粗血红素→抽滤→滤渣→烘干→研磨→血红素粗品。

1.2.3 血红素样品含量测定。称取20.0 mg研磨成细粉的血红素粗品，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液溶解，并定容到100 ml容量瓶，摇匀，过滤。再取10 ml滤液于100 ml容量瓶中，以0.1 mol/L氢氧化钠定容。以0.1 mol/L氢氧化钠作为试剂空白，在波长403 nm处测定血红素样品的吸光度（OD），代入回归方程即可求出血红素样品的含量。

1.2.4 单因子试验。 在利用冰醋酸提取血红素的方法中，主要影响血红素最佳提取条件的因素有反应温度、反应时间、冰醋酸的添加量、氯化钠的添加量等。试验以10 g猪血球反应物，以血红素含量为指标，反应温度为80、85、90、95、100 ℃；反应时间为10 、20 、30 、40 、50 min；冰醋酸添加量为猪血球的2、3、4、5、6倍；氯化钠的添加量分别为血球的0.8%、1.6%、2.4%、3.2%、4.0%。每一组试验做3次平行。

1.2.5 正交试验。在单因子试验的基础上，选择L9（34）正交试验表对反应温度、反应时间、冰醋酸添加量以及氯化钠添加量这4个因素进行优化，设置3水平因子，反应温度为85、90、95 ℃；反应时间为20、30、40 min；冰醋酸添加量为猪血球的3、4、5倍；氯化钠添加量为血球的1.6%、2.4%、3.2%。每一组做3次平行试验，正交试验因素水平设计如表1所示。

1.2.6 标准血红素供试液的制备。精密称取20.0 mg标准血红素对照品，用0.1 mol/L氢氧化钠溶解，并定容到100 ml的容量瓶中，摇匀备用。

1.2.7 标准曲线制备。分别精确称取标准血红素供试液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，用0.1 mol/L氢氧化钠定容到100 ml的容量瓶中，摇匀，以0.1 mol/L的氢氧化钠溶液作为空白对照，在403 nm波长处测定其吸光度（OD）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 试验得到不同浓度标准血红素供试液吸光度，见表2，并制作血红素标准曲线，如图1所示。

可见分光光度法测得血红素标准曲线为y=0.077 9x+0.005 4，R2=0.999 6。由图1可知，浓度在2.00～10.00 μg/ml范围内吸光度（OD）与浓度C呈线性相关。

2.2 反应温度对血红素提取量的影响 根据资料与预试验，选定反应时间为30 min，冰醋酸添加量为血球的4倍，氯化钠添加量为血球的1.5%，反应温度分别为80、85、90、95、100 ℃，考察反应温度对血红素提取的影响。由图2可见，当反应温度为95 ℃时，血红素提取量最高，超过95 ℃，提取量下降。因此，反应温度为95 ℃提取血红素较佳。

图2 反应温度对血红素提取量的影响2.3 反应时间对血红素提取量的影响 根据资料，选定反应温度是95 ℃，冰醋酸添加量为血球的4倍，氯化钠添加量为血球的1.5%，反应时间分别为10、20、30、40、50 min，考察反应时间对血红素提取量的影响。由图3可见，当反应时间为30 min时，血红素提取量最高。因此，取反应时间为30 min提取血红素效果较好。

图3 反应时间对血红素提取量的影响2.4 冰醋酸添加量对血红素提取量的影响 根据资料，选定反应温度是95 ℃，反应时间为30 min，氯化鈉添加量为血球的1.5%，冰醋酸添加量分别为血球的2、3、4、5、6 倍，考察冰醋酸添加量对血红素提取的影响。由图4可见，当冰醋酸添加量为血球的4倍时，血红素的提取量最高。因此，取冰醋酸添加量为血球的4倍提取血红素效果较好。

图4 冰醋酸添加量对血红素提取量的影响2.5 氯化钠添加量对血红素提取量的影响 根据试验，选定因温度是95 ℃，反应时间为30 min，冰醋酸添加量为血球的4倍，氯化钠添加量分别为血球的0.8%、1.6%、2.4%、3.2%、4.0%，考察氯化钠添加量对血红素提取的影响。由图5可见，氯化钠添加量为血球的2.4%时，血红素的提取量最高。因此，取氯化钠添加量为血球的2.4%提取血红素效果较好。

图5 氯化钠添加量对血红素提取量的影响2.6 正交试验 在单因素试验的基础上，选择L9（34）正交试验表对反应温度、反应时间、冰醋酸添加量以及氯化钠添加量这4个因素优化，进行正交试验，结果如表3所示。

由表3可看出，4个因素对血红素的提取量都会产生不同程度影响，对其反应的影响大小依次为：冰醋酸添加量>反应温度>反应时间>氯化钠添加量，因此得出最优组合为A3B2C2D2，即反应温度95 ℃，反应时间30 min，冰醋酸添加量为血球的4倍，氯化钠添加量为血球的2.4%为最佳条件。

方差分析得出，FA=3 260，FB=1 865，FC=3 575，FD=560，4个因素的F值都大于F0.01（2，8）=8.65，则4因素对血红素的提取量的影响极显著。

3 讨论

虽然有学者对冰醋酸提取血红素进行了研究，但他们采取的工艺参数存在较大的差异，且有关冰醋酸的添加量、反应时间、反应温度以及氯化钠添加量对血红素提取的影响报道较少。该试验采用冰醋酸法提取血红素得出反应温度95 ℃，反应时间30 min，冰醋酸添加量为血球的4倍，氯化钠添加量为血球的2.4%为最佳条件。

赵绪妙报道，向猪血中加入4倍血量的冰醋酸，在90 ℃条件下保温30 min来提取血红素[10]。而罗先隽提出，向猪血中加入4倍血量的冰醋酸，但提取血红素的温度为l00～105 ℃[11]。钟耀广提出，冰醋酸与血球比例为4.4∶1、温度为105 ℃、时间为40 min、氯化钠添加量为血球的1.5%为最佳工艺参数[12]。该试验所取的原料为全血，故消耗的冰醋酸较多。

利用冰醋酸提取猪血球中血红素的方法要求血液新鲜、卫生，血红素对光敏感，易氧化破坏，整个试验过程要避免强光照射，成品应保存于棕色瓶中。

新鲜猪血中含有大量凝血因子和凝血酶原，在钙离子存在时，凝血因子和凝血酶原被激活而发生作用，使血凝结成团，血液由流体变成凝胶，影响了血细胞的分离。因此，新鲜猪血必须采取抗凝措施。由于柠檬酸能使钙离子沉淀，并且柠檬酸与钙离子作用所得的生成物可直接进入代谢，对人体无副作用，故可选柠檬酸及其钠盐作为抗凝剂。

参考文献

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