高良姜叶枯病病原菌的分离和鉴定

陈旭玉 甘炳春 冯锦东

摘要 [目的]明确高良姜叶枯病病原菌。 [方法] 病原菌从高良姜感病组织上分离并依据柯赫氏法则进行致病性测定，病原菌的鉴定主要通过形态鉴定和ITS序列分析。[结果] 高良姜叶枯病病原菌确定为可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae），属子囊菌门（Ascomycota），座囊菌纲（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae），毛色二孢属（Lasiodiplodia）。 [结论]首次报道高良姜叶枯病病原菌为可可毛色二孢。

关键词 高良姜；叶斑病； 可可毛色二孢

中图分类号 S573 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05031-02

高良姜（Alpinia officinarum Hance）属姜科山姜属多年生草本植物，以根茎入药，是一种常见的南药[1]。其性热、味辛，具有温中、散寒、理气、止痛的功效[2]。高良姜主产于广东、广西、福建、台湾、海南、云南等地，在海南陵水、万宁、儋州等都有栽培[3-4]。海南种植的几块高良姜基地都发现叶枯病，严重影响了高良姜的发展。发病的叶片多从叶尖叶缘开始发病，病斑近圆形或不规则形，灰褐色，干斑病斑黄褐色，中央有灰白色，病健交界处有明显的黄色晕圈和较宽的褐色分界线。严重者整个叶片变黄干枯（图1）。目前国内外尚未见对高良姜叶枯病的研究，为了明确叶枯病的病原菌和有效控制叶枯病的蔓延，笔者对高良姜叶枯病病原菌进行研究，旨在为高良姜叶枯病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 从海南省万宁市药用植物研究所海南分所南药园等多个地点采集具有典型症状的高良姜叶枯病病叶，组织分离法获得菌株，纯化后，转入试管保存备用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离与纯化。 将具有典型症状的高良姜叶片用清水清洗干净，用75%乙醇浸泡1 min，用无菌水冲洗3～4次，再浸入10%次氯酸钠中消毒2 min，用无菌水冲洗3～4次。用解剖刀切下病健交界处在PDA培养基上培养，挑取形态不同的单菌落于新培养基上培养。采用琼脂平板稀释纯化法进行纯化，再将纯化的菌株分别转入试管斜面保存以供测定。

1.2.2 病原菌致病性测定。 将菌株的菌丝块分别接种于健康无病的叶片，采用刺伤的接种方法，接种后保湿。以接种无菌的琼脂块作为对照，逐日观察并记录其发病情况。

1.2.3 病原菌形态学观察。将柯赫法则验证后的菌株在PDA 培养基上培养30 d，观察菌落的颜色和形状，用显微镜观察分生孢子梗、分生孢子的形态。

1.2.4 病原菌分子鉴定。使用TIANGEN生化科技有限公司植物基因组试剂盒（DP320.02）进行真菌DNA提取，具体步骤参照其说明书。以真菌DNA为模板，ITS1/ITS4为引物进行PCR扩增。其序列为：扩增反应体系为：模板（真菌DNA） 0.5～1.0 μl，ITS1（10 μm）1 μl， ITS4（10 μm） 1 μl，2× Master Mix 12.5 μl，ddH2O 10 μl，PCR扩增程序为：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。

2 结果与分析

2.1 病原菌的致病性 通过菌块接种法，3 d后发现该病原菌浸染的高良姜表现出与田间发病植株相同的症状，并从中再次分离到该病原菌。而空白对照无症状出现（图2）。

2.2 病原菌鉴定 高良姜叶枯病原菌序列与NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上相似序列比對结果表明，该菌株与Lasiodiplodia theobromae（JX275790）的序列相似性为99%，结合形态特征，将该病原菌鉴定为可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）。属子囊菌门（Ascomycota），座囊菌纲（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae），毛色二孢属（Lasiodiplodia），病原菌孢子形态见图3。

3 结论与讨论

目前对高良姜的道地性、化学成分、药理作用等方面开

展了大量研究，但尚无高良姜病害的研究报道。为明确该病病原菌和有效控制病害的发生，该研究对病原菌进行分离并结合形态学特征和DNA分子序列将该病原鉴定为可可毛色二孢。可可毛色二孢是常见的病原菌之一，常引起枝枯病、裂皮病，褐腐病、果腐病等[5-9]，该研究首次报道高良姜叶枯病病原菌确定为可可毛色二孢，为有效防治该病害和深入研究提供基础。

参考文献

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