烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用

刘敏 顾志敏

摘要 [目的]获得高产量的烟草叶片原生质体。[方法]在前人的基础上，在酶浓度和酶解时间上，对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索；并以此为基础，通过双分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用。[结果]在纤维素酶浓度为1.3%，离析酶浓度为0.4%，果胶酶浓度为0.3%，酶解4 h，酶解温度28 ℃，并在简易纯化的条件下制备原生质体，所得到的完整原生质体产量最高，并且细胞碎片和杂质均最少。[结论]该方法为瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考。

关键词 烟草（Nicotiana benthamiana）；原生质体制备；双分子荧光互补试验；蛋白互作

中图分类号 S572 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05002-05

植物原生质体（protoplast）一词始自Hanstein，即指通过质壁分离，脱去细胞壁的细胞[1]。细胞壁是植物细胞的围墙，用其相对坚固的结构包围着其内部的原生质体，保护和支撑着植物细胞，其主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。在原生质体的所有分离方法中，酶解法效果最佳[2]。随着植物生物学的发展，原生质体已经越来越广泛应用于植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等研究领域[1]，是生理生化研究、基因表达调控研究、基因定位研究、细胞器制备、细胞融合和新品种培育等研究的理想材料[3]。

目前，原生质体在植物分子生物学领域应用非常广泛，其中就包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用研究。亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。GFP是绿色荧光蛋白，将所研究蛋白与GFP融合构建到一个同框阅读框内，然后转化到植物中，提取原生质体，在扫描共聚集显微镜的激光照射下观察绿色荧光信号，从而可以精确地定位蛋白质在细胞中的位置。植物原生质体双分子荧光互补试验（简称BiFC）使得活细胞内的蛋白互作可视化[4]。这种方法被成功的应用到不同生物中的不同表达系统。BiFC的基本原理是，增强的黄色荧光蛋白（eYFP）的片段通过分别融合到其末端的连接蛋白的互作重新形成荧光复合体。蛋白复合体的荧光能清晰观察到荧光的空间定位，如果连接的2个蛋白不互作，则只会形成背景荧光[5-6]。

烟草作为一种模式植物，其发育生长周期非常快，在短期内就能繁育多代。且易于进行农杆菌侵染试验，荧光蛋白分子在烟草内瞬时表达后，易于观察。国内外众多研究者提出了许多制备烟草原生质体的方法，比如机械法、化学法和酶解法等，其中酶解法是目前最有效、最快速、效果最佳的分离植物原生质体的方法[2]。目前很多文献只是提及烟草原生质体制备的方法和步骤，对其在植物分子生物学中的应用研究鲜有报道。因此，笔者优化烟草原生质体制备过程中多种因素的设置，并利用改良后的制备体系，以期为烟草原生质体在蛋白互作中的应用提供一些可供参考的范例。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。烟草种子（Nicotiana benthamiana），由浙江師范大学现代农业生物技术与作物病害防控重中之重学科提供。

1.1.2 载体。所用BiFC载体pSPYCE.A、pSPYCE.C和pSPYNE.B、pSPYNE.D均由实验室构建保存；CBL1n：OFP为质膜定位标记蛋白和TPC1：OFP为液泡膜定位标记蛋白，均由德国明斯特大学Jorg Kudla提供。将以上载体经冻融法转化入GV3101农杆菌中。

1.2 方法

1.2.1 样品的初处理。取烟草种子，用75%的酒精浸泡30 s后，蒸馏水冲洗，然后用30%的次氯酸钠浸泡30 min，再用蒸馏水浸种过夜。次日，播种于适宜湿度全元素培养土中，置于恒温培养箱（光照14 h，28 ℃；黑暗10 h，25 ℃）培养；长出4片叶（约25 d）或6片叶（约35 d）时移栽至单个塑料培养杯内。移栽培养约25 d后进行农杆菌侵染。

1.2.2 农杆菌浸染接种。采用Walter的方法[4]并作修改。挑取含重组质粒的农杆菌于YEP液体培养基（Kan，75 μg/ml；Rif，25 μg/ml）中，28 ℃振荡培养24 h；取60 μl菌液至含有终浓度为2 mmol/L MgSO4、10 mmol/L MES（pH5.8）、75 mg/L Kan、50 mg/L Rif和20 μmol/L AS的YEBi培养基中扩大培养，至OD600约为0.7左右；4 ℃，5 000 r/min离心10 min，去上清；加入含有终浓度为10 mmol/L MES（pH 5.8）和200 μmol/L AS的MMAi培养基于25 ℃，65 r/min条件下恢复培养3～4 h，至OD600约为2.8；将含pSPYCE.X载体的农杆菌菌液分别跟含pSPYNE-Y载体的农杆菌菌液等体积两两混合，振荡混匀；在每株4～8周大小的本氏烟上选取3～4片叶片，用1.0 ml注射器针头在选取的每片叶片背部刺1～2个小孔，一只手按住叶面的小孔处，另一只手用无针头的针管从叶的背面将菌液沿小孔慢慢注入叶片组织空隙中；浸染接种后的烟草置于24 ℃条件下培养；农杆菌侵染后3～7 d可进行原生质体制备。

1.2.3 原生质体制备。原生质体制备过程中使用到的试剂参考Walter的方法[4]。

1.2.4 原生质体的快速游离和纯化。取农杆菌侵染3 d后的烟草叶片，用尖头镊子夹住叶脉，从叶柄到叶尖方向撕取叶下表皮0.2～0.3 g，展平置于500 mmol/L 甘露醇中，培养30～60 min；甘露醇培养后，吸除甘露醇，加入500 μl的原生质体溶解液，真空培养5 min；45 r/min，28 ℃暗培养4 h，使原生质体充分释放。原生质体的简易纯化参考Walter的方法[4]，其中转速调整为300 r/min。通过共聚焦显微镜快速分析所制备的原生质体。

1.2.5 原生质体的观察。吸取40 μl制备好的原生质体溶液，制片，置于荧光共聚焦倒置显微镜（Leica TCS SP5）下，用相应波长激发光激发，显微镜倍数设置为20×0.7，观察视野内原生质体数并拍照，每个重复随机选取10～50个视野拍照。试验最终使用的W5均为80 μl。

1.2.6 原生质体的计数。（1）不同酶浓度组合所获原生质体比较.试验重复3次，每次观察50个视野。以下“原生质体数/个”表示50个视野内原生质体个数的平均值。（2）不同酶解时间所获原生质体比较。试验重复3次，每次观察10个视野。所用酶浓度为4%纤维素酶；1%离析酶（Japan），采用5个酶解时间对比。以下“原生质体数/个”表示10视野内原生质体个数的平均值。

所用盖玻片为22×22 mm2，单个视野大小为750×750 μm2，所以每0.2 g产生的原生质体数为（盖玻片面积/单个视野面积）×单个视野原生質体数均值×2。

1.2.7 原生质体产量的计算。每克本氏烟的原生质体产量=原生质体总数=单个视野原生质体数均值×（盖玻片面积/单个视野面积）×2×5。

2 结果与分析

2.1 简易大量制备原生质体条件探索

2.1.1 不同酶解时间所获原生质体比较。试验比较了不同酶解时间酶解原生质体的情况；试验条件为采用5种酶解时间对比，所用酶浓度为3.0%纤维素酶（Cellulose R.10 Japan）；0.75%离析酶（Cellulose R.10 Japan），其他条件相同。

2.1.2 不同酶浓度酶解效果比较。试验比较了在不同酶浓度下原生质体的解离情况；试验条件为采用4种酶浓度对比，酶解时间为4 h，其他条件相同。由表1和图3～4可知，纤维素酶（Cellulose R.10 Japan）浓度为1.3%，离析酶（Mecerozyme R.10及 Japan）浓度为0.75%，果胶酶（Pectinase R.10 Japan）浓度为0.1%时，原生质体产率最高，完整原生质体个数也最多，视野内杂质较少，原生质体清晰。

2.2 原生质体制备在蛋白互作研究中的应用 将连接了目的基因的BiFC双元载体转化入农杆菌GV3101，侵染本氏烟3 d后制备成原生质体。通过原生质体荧光定位，能更直观观察到互作蛋白在细胞内的定位情况。结果表明，连接了不同目的基因的BiFC双元载体侵染的烟草，其荧光定位于细胞内不同部位，包括质膜、液泡膜等。

2.2.1 质膜与核荧光定位分析。图5表明，A与B互作所形成的复合体，其荧光在质膜与核上均有分布[7]，在细中也有可能存在分布，这预示着A与B可能通过相互作用在质膜与核上行使其功能。

2.2.2 液泡膜荧光定位分析。植物液泡种类多样，并且其功能各不相同。植物细胞内主要分布有中央大液泡和贮存性液泡[8]，其上分布的蛋白可能具有不同的功能。试验通过对烟草原生质体的观察，更清楚的观察到了液泡在细胞中的各种形态以及相应的荧光模式。图6左图表明，C/D复合体所形成的荧光可能位于中央大液泡PSV上，也有可能在细胞质中也有荧光分布。但或许由于拍摄角度的不同，其荧光的呈现不是规则的膜荧光；图6右图表明，复合体的荧光则聚集于靠近细胞边缘的液泡上，轻微的质壁分离可能导致了液泡膜形状的不规则。图7表明，E/F复合体所形成的荧光在细胞膜类似膜与囊泡膜上均有分布，这3类膜荧光分布图可能由于拍摄角度的不同使得荧光模式有不同的呈现形式。这些囊泡膜可能是未成熟的液泡。以上的结果预示着C与D以及E与F可能通过相互作用在液泡膜膜上行使其功能。

3 结论与讨论

对于烟草原生质体的制备方法，国内外许多研究者提出了许多的方法，比如有机械法、化学法和酶解法等，但很多方法都比较陈旧，并且效率非常低，在试验中可重复性不强。因此试验在前人研究的基础上，对高效、快速制备烟草原生质体的方法进行了优化，并对其在植物分子生物学中的应用进行了示例。结果显示，在纤维素酶浓度为1.3%，离析酶浓度为0.4%，果胶酶浓度为0.3%，酶解4 h，酶解温度28 ℃，并在简易纯化的条件下制备原生质体，所得到的完整原生质体产量最高，并且细胞碎片和杂质均最少，这对于瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考。

酶解时间在原生质体的制备中是一个非常重要的因素。酶解时间过短，酶解不充分，原生质体得不到很好的释放；酶解时间过长，质膜受到损伤[2，9]，原生质体的稳定性也较差，不利于制备以及最终的观察。原生质体失去细胞壁的保护后变得非常脆弱。因此，制备原生质体所用各种溶液中的渗透压稳定剂对于制备完整原生质体非常重要。尤其是原生质体悬浮液W5中的渗透压稳定剂，决定了最终完整原生质体的数量以及保存时间。原生质体的收集方法对于原生质体的产率和活力也非常重要[3]。试验采用了35 μm尼龙网过滤以及300 r/min的低速离心收集，降低了原生质体在收集过程中破碎的可能性。另外，对烟草来说，撕表皮法比剪碎法更利于原生质体的释放。撕表皮法对于烟叶的质量要求较高，起皱的叶片不利于原生质体的制备，平展健壮的叶片更佳。

将本氏烟叶原生质体制备应用到BiFC中，先侵染后制备的方法，相比于其他生物如水稻原生质体的先制备后侵染，更高效更直观。相比于完整烟叶细胞中的荧光定位，原生质体中的荧光定位能更清晰明了地观察到蛋白互作位点或蛋白的亚细胞定位位点。这一点对于蛋白功能的明确大有裨益。近年来，烟草原生质体制备在BiFC中的应用极大地推动了蛋白互作以及蛋白功能确定的研究，已经成为细胞中各细胞器或其他组成物质功能研究的重要手段。

参考文献

[1] 陈占洲，李怀方.烟草原生质体在植物病毒研究中的应用[J].安徽农业科学，2006，34（6）：1119-1122.

[2] 陈名红，熊立，陈学军.烟草叶肉原生质体分离和纯化研究[J].云南民族大学学报：自然科学版，2005，14（4）：326-329.

[3] 江力，孔小卫，吴晓杰，等.烟草原生质体的分离纯化[J].安徽大学学报：自然科学版，2006，30（6）：91-94.

[4] MICHAEL WALTER，CHRISTINA CHABAN，KATIA SCHUTZE，et al.Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluore-scence complementation[J].The Plant Journal，2004，40：428-438.

[5] 陳菁.双分子荧光互补技术及其在蛋白互作研究中的应用进展[J].生物医学工程研究，2008，27（4）：302-306.

[6] RAINER WAADT，JRG KUDLA.In Planta Visualization of Protein Interactions Using Bimolecular Fluorescence Complementation（BiFC）[J].Protocol，2008，3：101-108.

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[8] 廖祥儒，陈彤，刘小丽.植物液泡的形成及其功能[J].细胞生物学杂志，2002，24（2）：95-101.

[9] EBRAHIM FRIOOZABADY.Rapid plant regeneration from Nicotiana mesophy protoplasts[J].Plant Science，1986，46（2）：127-131.