利用RAPD分子标记对30份山茶属种质资源进行分类分析

晏嫦妤 黄华林 李家贤 何玉媚

摘要 [目的]对30份山茶属种质资源进行分类分析。[方法]利用RAPD分子标记技术研究30份山茶属种质资源的遗传多样性，并进行分类分析。[结果]17个RAPD引物共扩增出138条带，多态性条带为129条，多态性比率为93.5%，材料间的遗传相似系数（GS）变化范围为0.605～0.855。[结论]利用NTSYS软件对RAPD扩增结果进行聚类分析，可将30份资源分为5大类群，其分类结果与张宏达分类体系基本一致。

关键词 山茶属种质资源；RAPD；分类

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-04962-02

山茶属（Genus Camellia）是山茶科（Theaceae）中最大、系统上较原始的一个属。我国是该属植物的分布中心，拥有绝大多数的种类，无论对于亚属（Subgenus）、组（Section）还是种（Species）的划分，山茶属植物在分类学上都争议较大。Sealy[1]、张宏达[2]以及闵天禄[3]在各自的研究基础上提出了世界著名的3大山茶属分类系统，但是这3大分类系统之间存在巨大分歧。因此，关于山茶属资源的分类研究仍是研究者关注的热点。随着分子生物学的不断发展，从DNA分子水平揭示植物系统演化关系，使植物系统学研究进入了一个新的时代。笔者根据张宏达分类体系中的分类选择了山茶属中2个亚属的5个组的资源，应用RAPD分子标记技术对其进行分类分析，旨在对现存分类学的结果进行初步的验证，并为解决山茶属分类分歧问题提供新的证据。

1 材料与方法

1.1 材料 试验材料均采自广东省油茶种质资源圃（英德），采集新鲜枝条，带回实验室取一芽二叶叶片，用液氮处理后置于-80 ℃冰箱冷冻保存备用。采集的种质资源的名称及原产地见表1。

1.2 基因组DNA的提取 采用CTAB法[4]从供试材料中提取基因组DNA，经质量检测后，稀释至200 ng/μl，于-20 ℃保存，用于后续的RAPD分析。

1.3 RAPD扩增 RAPD引物采用40个随机引物，筛选出扩增多态性条带多，稳定性强，背景清晰的引物17条（表2）。RAPDPCR反应体系为25 μl，包括，模板DNA 50 ng，引物0.5 μl，2×PCR mix（含Taq酶，dNTP，Mg2+等）12.5 μl，用ddH2O补充至25 μl。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性50 s，37 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。RAPDPCR产物在1.6%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用自动凝胶成像系统拍照分析。

1.4 数据分析 将电泳图谱清晰且可重复的 DNA 条带记为1，同一位置上的弱带且不重复或未出现条带的记为0，形成“1，0”原始数据矩阵，利用 NTSYSpc（2.10）数据分析软件进行数据分析，采用 UPGMA 方法构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 30份山茶属种质资源的多态性分析 使用17个随机引物对30个供试材料进行扩增，共扩增出138个位点，其中多态性条带为129条，占总条带数的93.5%，每个引物平均获得7.6条多态性条带（图1）。

2.2 30份山茶属种质资源的聚类结果分析 利用 NTSYSpc（2.10）数据分析软件，用UPGMA 法建立了30份山茶属种质资源间的遗传关系RAPD聚类分析图（图2）。RAPD聚类分析结果表明，30份种质资源间的相似系数在0.605～0.855，当相似系数为0.665时可将30份种质资源划分为5大类群。第1类只有1份资源——金花茶（样品号：30）。第2类也只有1份资源——张氏红山茶（样品号：29）。第3类包括包含2份资源：新兴红花油茶（样品号：3）和广宁红花油茶（样品号：6）。第4类包含3份资源：香花糙果茶（样品号：1）、青皮糙果茶（样品号：9）和红皮糙果茶（样品号：10）。第5类包括23份资源，可分为2个亚类：第1亚类包括软枝油茶3#（样品号：2）等9份资源，第2亚类包括广宁白花油茶（样品号：12）等14份资源。

山茶属植物是异花授粉植物，遗传组成上的高度杂合和表现形上的多态性给植物分类带来了困难，这也是山茶属植物分类至今未能定论的主要原因。DNA分子标记是DNA序列信息的直接或间接反应，为植物系统学的研究提供了大量的信息数据，DNA分子标记的分类结果能够对现存的分类学结果进行验证，并可能提出新的见解，做出合理的修订。

通过对比发现，试验中RAPD分子标记与张宏达分类体系中对不同组的划分基本一致，但稍有区别。根据张红达分类体系可知，30份供试资源分属于2个亚属5个组，其中22份资源属于山茶亚属油茶组，窄叶短柱茶属于山茶亚属短柱茶组，金花茶属于茶亚属金花茶组，张氏红山茶、广宁红花油茶和新兴红花油茶属于山茶亚属红山茶组，青皮糙果茶、红皮糙果茶和香花糙果茶属于山茶亚属糙果茶组。从RAPD聚类分析结果看，22份油茶组资源和窄叶短柱茶聚为一类，说明这2个组的亲缘关系较近，支持了闵天禄对油茶组和短柱茶组合并的观点[5]。红山茶组的3份资源，广宁红花油茶和新興红花油茶聚为一类，而张氏红山茶未与这2份资源聚在一起，分析可能的原因为：在张宏达分类体系中是根据其花色等生物学性状进行分类的，但张氏红山茶具有四季开花特性，属多季开花植物，其生理特性与其他2份资源有差异，因此在DNA水平上张氏红山茶与广宁红花油茶和新兴红花油茶可能存在较大差异；糙果茶组的3份资源聚为一类，金花茶单独为一类，这2组的划分与张宏达分类体系中的分类一致。据邓白罗[6]等研究表明，RAPD分析结果基本上支持张宏达的山茶属红山茶组植物分类方法，说明形态上的相似性与DNA的相似性有很强的相关性，试验结果也表明，RAPD的分类结果与张宏达分类体系较为一致，但也存在部分差异。因此，利用分子标记方法，并与传统分类方法进行相互验证，将使山茶属植物的分类系统趋于更加科学合理化。

参考文献

[1] SEALY J R.A revision of the genus Camellia[M].London：the Royal Horticulture Society，1958.

[2] 张宏达，任善湘.中国植物志，第49卷，第3分册[M].北京：科学出版社，1998.

[3] 闵天禄.世界山茶属的研究[M].昆明：云南科技出版社，2000.

[4] 黄建安，黄意欢，罗军武，等.茶树基因组DNA的高效提取方法[J].湖南农业大学学报，2003，29（5）：402-407.

[5] 闵天禄.山茶属山茶组植物的分类.分化和分布[J].云南植物研究，1998，20（2）：127-148.

[6] 邓白罗，谭晓风，漆龙霖，等.山茶属红山茶组植物的RAPD分析及分类研究[J].林业科学，2006，42（5）：36-40.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：4969-4970，4973

责任编辑 石金友 责任校对 李岩