农产品中玉米赤霉醇ELISA检测试剂盒的研制与应用

王东　王刚　饶力群

摘要 [目的]建立快速、有效检测农产品中玉米赤霉醇（ZER）残留量的方法。[方法]试验以人工合成的ZER为包被原，ZER为竞争半抗原，两者与一定量的抗玉米赤霉醇單克隆抗体反应，应用间接竞争ELISA法建立玉米赤霉醇单克隆抗体快速检测农产品中ZER含量的半定量检测，同时对该ELISA试剂盒进行了调试。[结果]试验建立检测ZER的ELISA方法，其最适包被浓度为1∶5 000，抗体最适工作浓度为1∶2 500，酶标二抗的最适工作浓度为1∶5 000。试剂盒检测限为0.5 ng/ml，添加回收率在70.0%～116.0%，变异系数小于20%，在2～8 ℃条件下可保存90 d。[结论]该试验建立的方法可应用于玉米、小麦、高粱等中的玉米赤霉醇的检测，应用前景广阔。

关键词 玉米赤霉醇；单克隆抗体；间接竞争；检测限；ELISA

中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06764-03

Development and Application of Zeranol and ELISA Kit in Agricultural Products

WANG Dong et al

（College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

Abstract [Objective] To establish a method for rapidly and effectively detecting ZER in agricultural products. [Method] With ZER package as original， ZER as hapten for competition， both with a certain amount of resistance to zeranol monoclonal antibody response. The indirect competitive ELISA method was used to establish the zeranol monoclonal antibody rapid detection ZER content in the semiquantitative detection of agricultural products. At the same time the ELISA kit was tested. [Result] ELASA method was established to detect ZER， the optimal concentration of package， IgGHRP are 1∶5 000，the optimal concentration of antibody is 1∶2 500. The detection limit of kit is 0.5 ng/ml， adding recovery rate 70.0%-116.0%， variation coefficient is less than 20%， which can be stored for 3 months under 2-8 ℃. [Conclusion] The method can be used in detection of ZER in maize， wheat， sorghum with broad prospect.

Key words Zeranol； Monoclonal antibody； Indirect competition； Detection limit； ELISA

玉米赤霉醇（ZER）属雌性激素[1]，具有维持副性征和代蛋白同化效应，除用于一般治疗用途外，还作为生长促进剂应用于反刍动物（尤其是牛羊）[2]。20世纪90年代末，人们发现食用含有玉米赤霉醇残留的农产品会引起人体性机能紊乱，影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下还可能致癌。其次，ZER排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染。1998年，欧盟禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖，我国农业部第235号公告明确规定玉米赤霉醇禁用于所有食品，判定检测标准为2 ng/ml[3]。目前国际上农产品中玉米赤霉醇残留检测方法[4]主要有液-质联用法和气-质联用法及液相色谱-串联质谱测定方法。此类仪器检测方法，准确度高，精密度好，可作为药残检测的最终确证，但其样本前处理复杂、检测时间长、需要昂贵的仪器设备，且对试验操作人员要求高。同酶联免疫检测法（ELISA）比较，后者具有灵敏度高、特异性强、仪器化程度低和样品前处理相对简单，对试验人员要求也相对容易掌握等优点，特别适于残留现场监控和大样本筛查，故建立一种准确、快速的ELISA检测方法极为重要。笔者开发的玉米赤霉醇ELISA检测试剂盒可应用玉米、小麦、高粱以及饲料等中的玉米赤霉醇的检测。

1 材料与方法

1.1 材料

包被原：玉米赤霉醇与卵清蛋白偶联的抗原。

抗体：玉米赤霉醇与蛋白质偶联抗原的单抗。

稀释液：抗原稀释液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液；

抗体稀释液为0.05 mol/L含有0.05 ml牛血清白蛋白、保护剂的磷酸盐缓冲液；

封闭液为含有0.5%酪蛋白、1%小牛血清、5‰防腐剂（叠氮钠）的磷酸盐缓冲液；

酶标记物稀释液为含有5%小牛血清和保护剂的缓冲液。

酶标二抗：羊抗鼠抗抗体，杭州隆基生物技术有限公司。

底物显色液：2 mol/L四甲基联苯胺和4 mol/L过氧化氢。

终止液：2 mol/L浓硫酸。

空白牛尿样本来源于湖南省饲料监察所。

1.2 方法

1.2.1 反应原理。

该试验采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物玉米赤霉醇与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗玉米赤霉醇的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含玉米赤霉醇的含量呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出残留物玉米赤霉醇的含量[5]。

间接竞争ELISA反应历程为：1包被过程→2包被原与抗原竞争抗体→3酶与结合在微孔上的抗体结合→4酶催化底物显色（图1）。

1.2.2 试验条件体系建立。

在文献[6]的基础上，利用棋盘法测定包被原、稀释液等。在文献[7-9]的基础上，确定试验条件、试剂盒的灵敏度和准确度的验证、试剂盒的保存等试验。试剂盒标准曲线的建立[7]，如图2所示。

2 结果与分析

2.1 最适包被液浓度分析

由表1可见，随着包被原浓度的降低，IC50的变化幅度不大，但最大吸光值降低。1∶20 000稀释时最大吸光值较低。当做1∶5 000稀释（浓度为0.2 ng/ml）的包被原IC50和吸光值均較好（根据朗伯-比尔定律以及试验经验得出：最大吸光值理想范围为1.500～2.000）。

2.2 单抗稀释液的选择

试验结果表明（表2），选择最大吸光值较大，IC50较低，添加回收率较高的较符合的单抗稀释液作为试剂盒的单抗稀释液，故选择单抗稀释液D。

2.3 包被条件的确定

试验结果表明（表3），选择最大吸光值较大，IC50较低，空白本底较低，添加回收率较高的包被条件作为试剂盒的包被条件，4 ℃过夜虽IC50较低，但最大吸光值和添加回收率也相应降低，说明包被原未能很好地吸附于酶标板上；37 ℃温育1 h，再4 ℃过夜与37 ℃温育2 h，再4 ℃过夜差异不显著，从节省时间考虑，故选择37 ℃温育1 h，再4 ℃过夜（表3）。

2.4 封闭时间的确定

试验结果显示（表4），选择最大吸光值较大，IC50较低，空白本底较低，添加回收率较高的封闭条件作为试剂盒的封闭条件，封闭30 min虽空白本底较低，但IC50升高，可见非特异性反应增加；封闭60 min与封闭120 min差异不显著，从节省时间考虑，故选择封闭60 min。

2.5 试剂盒灵敏度分析

评价竞争酶联免疫吸附试验反应灵敏度的方法，常用的有IC50抑制浓度（指零标准溶液吸光度值的50%处所对应的药物浓度）和最低检测限，两者值越低说明试剂盒的灵敏度越高。最低检测限的定义有多种，一般规定20份空白样品或零标准品的测定平均值加3倍标准差为试剂盒的最低检测限。最低检测限与样品的种类、采样地区和样品的前处理方法等密切相关，可作为评价检测方法灵敏度的指标，但不宜作为检验试剂盒灵敏度的指标，而IC50不受样本影响，其值相对恒定，常用作评价竞争ELISA试剂盒灵敏度的指标。

IC50值与抗体和酶结合物的质量及检测方法有关，分别测定20次标准曲线的IC50抑制浓度（表5），玉米赤霉醇通过20次空白样本（空白样本来自兽药监察所，已用液质联用仪器检测确定）。

2.6 试剂盒特异性分析

表6结果表明，玉米赤霉醇单抗与β玉米赤霉醇、α玉米赤霉烯醇、β玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的交叉反应率分别为100.0%、36.25%、52.73%、0.67%、74.36%、53.70%；与己烯雌酚、雌二醇、睾酮、克伦特罗的交叉反应率均小于0.1%。ZER单抗与其结构相似的同系物有一定的交叉反应，但与功能相似的激素类药物无交叉反应。

2.7 试剂盒准确度分析

由表7可见，以10、21、35 ng/ml 3个浓度添加空白牛尿中，测得回收率在59.5%～111.6%，变异系数在6.4%～17.5%，符合准确度的测定标准。

2.8 试剂盒保存试验分析

同一批次试剂盒在37 ℃条件下保存时间0、1、3 d的变化，以及在2～8 ℃保存时间0、14、30、90、180 d的试验结果见表8。

3 讨论

在此次试验研究过程中，反应体系中的有机溶剂、反应环境pH及离子强度、反应温度等的影响，集中表现在对各种

工作液的筛选工作上，试验研究工作主要对最适包被浓度的

确定、稀释液对单抗和酶标二抗稀释的倍数确定、样品溶液与单抗溶液体积比例的确定、封闭液的确定等工作，为后期体系的建立提供必要的试验要素。试验研究对反应时间、反应物的量进行了筛选，为了达到ELISA酶联免疫试剂盒最终快速，在保证试验结果的准确性前提下，最终确定了单抗反应时间和酶标二抗反应时间均为1 h；单抗与标准品（或样品）的体积比为50 μl∶50 μl。

添加溶液比例、包被原、单抗、酶的浓度以及包被液和封闭液的选择直接影响试剂盒的IC50、灵敏度和精确度。在综合考虑原材料的用量试验效果以及对原料的合理应用条件下，经过试验对照，包被原选择1∶5 000，单抗选择1∶2 500稀释，酶选用1∶5 000稀释，一般浓度提高IC50提高、灵敏度降低。试验操作反应的适宜温度以及时间与试验结果的最佳值密切相关，如反应温度偏低，反应时间偏少，试剂盒处于极端条件下（如放在贴着冰箱壁，试剂冻伤）等都会造成试验的OD值偏低，继而影响试验数值的准确性，经过试验对比验证确定：单抗反应时间为60 min，酶标二抗反应时间为60 min，底物显色条件37 ℃显色10 min以及试剂盒的保存试剂盒在2～8 ℃条件下可保存90 d。

该试剂盒检测限为0.5 ng/ml，添加回收率在70.0%～116.0%，变异系数小于20%，在2～8 ℃条件下可保存90 d。整个体系反应时间为130 min，比仪器方法（气相、液相方法等）节省很多时间，玉米赤霉醇ELISA快速检测方案试验体系建立成功，达到了检测体系快速、定性半定量的目的并具有很广泛的前景。

参考文献

[1] 蒋学之.环境雌激素对人类健康的潜在影响[J].中国公共卫生，1997，13（4）：251-252.

[2] 林书康，游存华.牛羊增重剂——玉米赤霉醇[J].黄牛杂志，1992（4）：62-66.

[3] 中国兽医药品监察所.农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》[R].2002-12-24.