分子标记在我国红豆杉科保护植物中的应用

毛庆家

摘 要： 简述了我国红豆杉科保护植物的种类，对几种DNA分子标记技术在红豆杉科保护植物中的应用，特别是对红豆杉属植物在遗传多样性、分类学、性别鉴定、特定性状的连锁标记、分子标记的开发等方面进行了详细阐述，同时指出了今后分子标记应用的重点。

关键词： 红豆杉科；保护植物；分子标记

中图分类号：S791.49 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2014）04-0023-06

分子标记自问世以来短短几十年已发展到数10种。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的序列或蛋白质，而狭义的分子标记仅指DNA标记。现有的DNA分子标记可分为三类：第一类是通过限制性酶切消化结合Southern杂交技术获得的标记，如RFLP（限制性片段长度多态性）标记[1]。第二类是通过PCR扩增获得的标记，如RAPD（随机扩增多态性DNA）标记[2]。第三类是通过限制性酶消化和PCR扩增相结合所获得的标记，如AFLP（扩增片段长度多态性）标记[3]。根据扩增产物有无特异性，基于PCR 的分子标记又可分成特异标记和非特异标记2类。常用的非特异标记有RAPD、AFLP、ISSR（简单序列重复区间扩增） [4]和SRAP（相关序列扩增多态性）[5]，特异标记有SSR（简单序列重复）[6]等。本文主要阐述了这几种分子标记在红豆杉科保护植物中的应用进展。

1 我国红豆杉科保护植物的种类

红豆杉科有5个属，分别是穗花杉属、榧树属、澳洲红豆杉属、白豆杉属和红豆杉属。除澳洲红豆杉属生长在南半球外，其余均产自北半球，分布于欧亚和美洲大陆的寒温带、温带和亚热带地区。红豆杉科红豆杉属植物为针叶树类植物，通常认为世界上有9个种，我国共有3 种2 变种，分别是东北红豆杉Taxus cuspidata、密叶红豆杉T. fuana、须弥红豆杉T. wallichiana、红豆杉T. wallichiana var. chinensis和南方红豆杉T. wallichiana var. mairei，均为珍稀濒危保护植物[7]。

红豆杉属植物集药用、材用和观赏等于一体，尤其是其树皮、枝叶中含有抗癌特效药物紫杉醇而非常珍贵。紫杉醇是目前世界上最好的抗癌药物，具有极高的开发利用价值。为保护红豆杉属自然资源免遭灭绝，根据国务院1999年8月4日批准的国家林业局、农业部申报的《国家重点保护野生植物名录（第一批）》，红豆杉科国家Ⅰ级保护植物有：台湾穗花杉Amentotaxus formosana、云南穗花杉A.yunnanensis、红豆杉属所有种Taxus spp.；国家Ⅱ级保护植物有：白豆杉Pseudotaxus chienii、榧属所有种Torreya spp.。

2 常用分子标记在红豆杉科国家保护植物中的应用2.1 RFLP标记

红豆杉科在我国有4个属即红豆杉属、白豆杉属、穗花杉属和榧树属，它们均是研究裸子植物系统发育的重要材料。王艇等[8]通过对rbcL基因进行PCR-RFLP 分析对红豆杉科的一些基本系统学问题进行了研究，结果表明红豆杉科是一自然的单系群得到了RFLP标记的有力支持；红豆杉属构成了穗花杉属、白豆杉属和榧树属的姊妹群；穗花杉属和白豆杉属宜置于红豆杉科内处理为属，不赞同将这两个属分别独立成科的观点；白豆杉属同榧树属的关系密切。

2.2 RAPD标记

2.2.1 遗传多样性研究

张宏意等[9]基于RAPD 分子标记对广东、湖南和江西12 个南方红豆杉自然居群的遗传多样性进行研究，从100 个引物中共筛选出10个，获得谱带86条，多态性位点百分率（PPB）占51.16%，粤北9个居群的遗传多样性较低。聚类分析结果表明，不同产地个体间的遗传距离较大。

苏建荣[10]采用RAPD技术对须弥红豆杉遗传多样性进行了研究，PPB值高达93.72%，仅低于曼地亚红豆杉（94.9%）[11]，而高于南方红豆杉（51.16%）[9]、欧洲红豆杉（82.92%）[12]、加拿大红豆杉（20.6%）[11]、欧洲红豆杉（86.5%）[11]、东北红豆杉（76.84%）[11]。

茹文明等[13]采用RAPD 技术检测了山西南部南方红豆杉8个种群的遗传多样性。21个引物共检测出134个位点，其中多态性位点123个，占91.79%。南方红豆杉种群内平均遗传多样性为1.493，总的遗传多样性平均为2.180，在总的遗传变异中，大部分存在于种群内（68.3%），种群间占31.7%。在南方红豆杉种群总的遗传变异中，种群内个体的遗传变异大于种群间个体的遗传变异。

郑超等[14]采用RAPD标记研究了分属于4 种红豆杉属植物的68个单株的遗传多样性，南方红豆杉的多态性条带百分率最高，达56.0%，而须弥红豆杉的多态性条带百分率最低，为43.1%。南方红豆杉和须弥红豆杉的遗传距离最近，为0.289 3，这一研究结果支持在Flora of China[7]中将南方红豆杉作为是须弥红豆杉1个变种的分类处理，

2.2.2 遗传分化研究

王艇等[15]用20个RAPD标记引物对国家二级保护植物白豆杉11 个种群共计91个体的DNA 样品进行扩增，得到264条谱带，平均每个引物扩增出13.20条，多态位点百分率为76.14 %。根据白豆杉种群RAPD 数据矩阵计算出的Nei基因分化系数GST值为0.586 5，表明白豆杉种群间发生了极其显著的遗传分化。

由于白豆杉种群间已发生高度遗传分化，所以建议在保育过程中尽量避免在种群之间实施种质迁移，最好不在分化显著的种群间人为移栽个体。

2.2.3 亲缘关系研究

李斌连[16]利用RAPD标记从64个RAPD引物中筛选出有带的引物9个，检测出的多态性条带占总条带数的比例（PPB）约为27%，说明红豆杉属植物之间的遗传差异不大。通过聚类分析，栽培的密叶红豆杉和栽培的曼地亚红豆杉（Taxus ×media）的遗传上较为相似，与南方红豆杉亲缘关系次之；而南方红豆杉各变种间亲缘关系因取材地域不同也有一定的差异。

2.2.4 分子系统学研究

王艇等[17]采用RAPD技术研究了红豆杉科植物红豆杉、南方红豆杉、白豆杉、穗花杉Amentotaxus argotaenia 、云南穗花杉和云南榧树Torreya yunnanensis等6种植物，在分子水平上对红豆杉科植物的系统发育进行了探讨。RAPD分析表明， 红豆杉与南方红豆杉的遗传距离较小（0.121）， 从聚类分析的结果可见在种一级的水平上其遗传分化是非常小的，不支持将红豆杉再分为两个独立种的意见。

王贵荣等[18]利用RAPD进行多态性检测，参试的6 种红豆杉的多态性条带占总条带数的比例（PPB）约为44.8%，说明供试红豆杉材料的遗传基础较窄，各个种之间的遗传分化比较小，但它们的染色体数完全一致，2n=24条。该试验发现南方红豆杉与中红豆杉的亲缘关系最近， 这与中国植物志[19] 将南方红豆杉作为红豆杉的一个变种相一致。

2.2.5 与紫杉醇含量相关的RAPD连锁标记研究

陈毓亨等[20]最早做了南方红豆杉紫杉烷含量与RAPD相关性分析研究。在RAPD标记中，紫杉醇高含量样品具有区别于所在地区其他个体的扩增条带，如峨眉山有30条，云南有15条，武宁仅4条。云南和峨眉山的2个样品一定程度上似与它们的形态差别有一定的联系。而武宁2个样品的形态和生态与所在地区其他样品没有区别，但在DNA条带上有一定差异。因此，这些条带已在一定程度上排除了形态和生态的影响。21个引物中，有9个引物出现仅见于两个地区间（如四川与云南或云南与江西）高含量紫杉烷样品的共同的特征性条带。RAPD扩增结果的UPGMA 聚类分析也表明，这7个样品都分别与所在地区内其他个体有一定的遗传距离，说明这些高含量样品都不同程度地从地区中分化出来，各自形成自己的分子特征。就上述初步研究而言，在南方红豆杉中至少存在3个高含量紫杉烷植株系。

苏建荣等[21]对所有采样的须弥红豆杉植株开展了RAPD标记与不同器官紫杉醇含量的关联研究。筛选出了指示树皮、小枝、针叶紫杉醇低含量的RAPD 特异性条带分别为4 条、2 条和5 条；指示树皮和针叶紫杉醇次低含量的特异性条带各1条。利用它们可缩小高含量紫杉醇植株的筛选范围，减少筛选成本和工作量，具有一定的生产意义。而与陈毓亨等[20]的南方红豆杉研究结果不同，须弥红豆杉未筛选出指示紫杉醇高含量的特异性RAPD标记。

2.3 AFLP标记

2.3.1 遗传多样性和遗传分化研究

江建铭等[22]应用AFLP标记方法对（南方）红豆杉种质资源遗传多样性研究，从32对引物组合中筛选了10对引物组合，共扩增出多态性位点107个，多态性位点占总扩增位点的比例平均为78.1%。

同年，于晓芹等[23]应用AFLP标记方法，得出不同居群的多态位点比例从27.32%～41.53%（PPB）。AMOVA分析结果表明：须弥红豆杉居群间的变异是居群内变异的2倍（各居群间变异占66.70%，居群内变异占33.30%），表明须弥红豆杉居群变异成分主要发生在居群间；各居群间的遗传分化系数Fst为0.67，表明居群间的遗传分化极显著。PopGene所得基因分化系数Gst为0.554 5 （低于Fst值）同样表明居群间的遗传分化极显著。

2.3.2 性别鉴定研究

肖璐等[24]利用AFLP技术，从64对引物组合中筛选出了7对引物组合，在雌雄基因池中表现出差异，共扩增出11条差异性条带，其中在雄株中只扩增出1条差异性条带，在雌株上扩增出10条差异性条带，但这11个与性别相关的AFLP标记，其DNA序列能否作为候选有价值的性别鉴定探针或发展为PCR引物，还需进一步深入研究。

2.4 ISSR标记

ISSR标记在南方红豆杉中的应用仅限于其遗传多样性和遗传分化的研究。

张蕊等[25 ]利用8个ISSR引物对15个种源的南方红豆杉进行PCR扩增，共检测到90个位点，其中89个位点呈现多态性，多态性位点百分率为98.89%，说明其在物种水平上的遗传多样性丰富。南方红豆杉种源遗传多样性受其产地经度和纬度非线性共同影响，偏南和偏西地区种源的遗传多样性较低，偏东和偏北地区种源遗传多样性则较高。因试验的南方红豆杉种源其原产地种群皆是较大的古树群， 片断化的时间较短， 加上其特有的繁育特性， 种源间基因分化系数为0.121 1，仅有8.75%的遗传变异存在于种源间，而91.25%的遗传变异来自于种源内。

李乃伟等[26]采用ISSR 标记技术对南方红豆杉迁地保护小种群及其衍生自然种群5个小斑块（小居群） 的遗传多样性行了分析。从90条引物中共筛选出10 个多态性引物，获得ISSR 谱带102条，其中多态性谱带74条，占72.54%。聚类分析结果表明：南方红豆杉迁地保护各自然小居群间的遗传距离与这些居群的地理生境有关， 而与地理距离并没有显著相关性。其主要原因是各小居群为衍生自然居群内部的分区， 虽呈斑块分布但未形成严格的区域隔离，可以视为一个居群整体，从而与针对具有严格区域隔离的大范围的植物居群的分析结果有所不同。

李乃伟等[27]采用ISSR 标记方法，对南方红豆杉3个野生种群、2个迁地保护栽培种群及2个迁地保护衍生种群的遗传多样性进行了分析和比较。合并后的迁地保护衍生种群以及野生种群均有较高的遗传多样性，二者的PPB值相近，分别为78.08%和82.19%。这表明在植物园次生林环境条件下，回归到自然生境下的南方红豆杉迁地保护衍生种群的遗传多样性趋于丰富并接近野生种群，从而证明了植物园在濒危植物迁地保护中具有以往未被认识到的巨大潜力。为使植物园保护的植物小种群能够长久繁衍，在建立一个新的植物园之初，就应考虑供游人参观的开放区与供植物种群繁衍扩张的自然区的结合。

丁桂生[28]利用ISSR分子标记对来自10省区15个南方红豆杉种源共300株个体进行PCR扩增，共检测到90个位点， 其中89个位点呈现多态性，多态性位点百分率为98.89%，表明南方红豆杉物种水平上的遗传多样性丰富。AMOVA分析结果显示，南方红豆杉种源间的遗传变异较小，仅占总变异的8.75%，这是因为南方红豆杉为风媒异花授粉树种，传粉能力强，其种子具有红色带甜味的肉质假种皮，可借助鸟及鼠类的吞食而得以远距离传播，原有种群间的基因交流频繁，加之现有保留种群片断化的时间较短，未发生严重的遗传分化。

2.5 SRAP标记

任娜[29]首先利用传统的形态学鉴定方法对20株来自南方红豆杉和须弥红豆杉的供试菌株进行形态学鉴定，结果显示：20株供试菌株被分为4类。

为了筛选出更优良的紫杉醇产生菌，采用了相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记技术对20株红豆杉内生真菌菌株进行遗传多样性分析。结果显示：24对SRAP引物共扩增出584条带，其中多态性条带446条，多态性比率为76.4%。

在以相似系数0.601为阈值时，SRAP标记可将20株菌株分为4类，与传统的形态学分类相比较，SRAP技术能将20株真菌更准确的区分开来。

2.6 RAPD和ISSR标记的联合应用

张玲玲[30]运用RAPD标记对23个种源的南方红豆杉遗传多样性进行研究，筛选出的13个引物扩增出147条清晰带，其中多态性带136条，多态性条带比率为92.52%，表明南方红豆杉具有较高的遗传多样性。

ISSR标记使用12条引物对23个种源的南方红豆杉进行遗传多样性分析，共扩增145条清晰带，其中多态性带140条，96.55%的多态性条带比率高于目前已报道的其它作物。遗传相似性分析发现南方红豆杉种源遗传多样性较为丰富。

2.7 SSR标记的开发研究

吴琼[31]在东北红豆杉针叶454测序结果中，发现了753个简单重复序列（SSR）模体，大约85%的SSR模体长度在14～24 bp之间，SSR模体的分布密度为平均12.47 kb编码区有一个简单重复序列，频率为3.1%。六核苷酸有260种，约占34.5%，是最丰富的模体。其次为三核苷酸，有242种，约占32.1%，可见六核苷酸和三核苷酸构成了总的微卫星标记的一多半。

易官美等[32]利用基因组勘测序列（GSS序列）探讨开发南方红豆杉SSR标记的可行性。从1923条GSS序列中搜寻到184个SSR位点。其中二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复所占比例分别为88.6%、10.3%和1.1%。根据所获得的184个SSR位点设计引物，最终获得90个候选SSR引物，并用南方红豆杉进行PCR 验证，结果所有的引物都能获得稳定清晰的条带。验证结果表明，所开发的SSR 标记在基因组中的扩增结果多表现为清晰可读的单一主带，表明这些标记在基因组中的位置是特异的，能够有效地反映基因组的多态性，可以成为种子种苗鉴定及分子生物学等相关研究的有力工具。同时该研究结果也表明GSS数据可以有效地用于SSR标记的挖掘，为那些不具备全基因组数据的物种开发分子标记提供了新途径。

李炎林等[33]利用Trinity软件对NCBI公共数据库中南方红豆杉根、茎、叶的转录数据进行了转录组的重新拼接。通过SSR检测程序从96 279条Unigenes中得到2 160个SSR位点（2.24%），其平均发生率为1/18.01 kb，基序长度为14～25 bp之间。优势重复基序为六核苷酸和三核苷酸，分别占总SSR 位点的38.56%和37.08%。2 160个SSR 位点由703 种重复基序构成，其中六核苷酸占60.96%，二、三核苷酸占总SSR 位点的44.81%。随机挑选62 对SSR引物对8个南方红豆杉株系进行了SSR扩增，有效扩增率为53.23%，多态性比率为38.71%。

3 展望

SRAP是一种新型的基于PCR的非特异标记标记技术，与其它分子标记技术相比较，具有产率高、多态性高、共显性高、重复性好，在基因组中分布均匀，较易测序，便于克隆目标片段，操作简单，引物具有通用性，且其正、反引物两两搭配组合，提高了引物的使用率，降低成本。因此，SRAP也可用于红豆杉属植物的遗传多样性研究等。

在红豆杉科保护植物中所用到的分子标记大都局限于RAPD和ISSR等，其稳定性和重现性一直备受质疑。特异性分子标记具有重现性好，扩增靶序列在基因组中位置确定等优点，因而倍受研究者青睐。最常用的特异标记是SSR。近年来，许多植物中都开展了表达序列标签（EST）的测序工作，互联网上有关数据库中积累了大量的EST序列数据。从这些数据中可以发现，在EST序列中也存在SSR位点。因此，人们试图利用EST序列开发SSR标记，称为EST-SSR标记。

基因组勘测序列是基因组DNA克隆的一次性部分测序得到的序列，目前互联网上已登录了一些的南方红豆杉GSS 序列。GSS序列是NCBI的一部分，已经整合到了GenBank中，与EST数据库类似。区别在于GSS序列是从全基因组序列克隆两端获得的短的部分序列，而不是从cDNA 文库中获得的克隆，因此GSS 数据更能反映所研究生物全基因组的特征。这些多态性转录组SSR引物的开发将为红豆杉遗传多样性的分析、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供更丰富的标记。

参 考 文 献

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（责任编辑：郑京津）