西瓜未授粉子房的离体培养

李玲　闵子扬　童龙　李涵　成娟　孙小武

摘 要：为了探讨西瓜未授粉子房诱导率的影响因素，以‘早春红玉、‘西农9号和‘小绿皇为供试材料进行西瓜未授粉子房的离体培养，研究供体植株的黑暗热激处理、基因型、不同取样时间、2，4-D浓度和不同激素浓度组合等因素对其芽点诱导率的影响。结果表明：西瓜未授粉子房离体培养以33 ℃ 的条件下黑暗热激4 d效果最佳；以开花前1 d的子房诱导率最高为17.2%；3个品种中仅‘早春红玉获得了再生植株，且在激素组合为4.0 mg·L-1 2，4-D + 2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA时芽点率最高为15.0%；根据再生植株的根尖染色体数目，初步鉴定再生植株中有单倍体植株，还有二倍体和四倍体植株。

关键词： 西瓜； 未受粉子房； 诱导率； 离体培养； 单倍体； 影响因素

长期以来，西瓜常规育种周期长、工作量大、遗传性状不稳定等因素在很大程度上限制了西瓜的育种进程。在离体条件下，采用未授粉子房培养来获得单倍体植株，是在较短时间内获得综合性状优良、高度纯合二倍体的快速而有效的方法。目前，在葫芦科的一些作物上已经通过未授粉胚珠或子房的离体诱导培养途径成功获得了单倍体的植株。杜胜利[1]在黄瓜未受精子房的离体培养研究上得到了单倍体植株，并己将研究应用到黄瓜的新品种选育上。2009年，葛志东[2]在西葫芦未受精的子房培养中也得到了单倍体的植株。但是在西瓜上这方面的报道甚少。只有杨颖[3]通过未授粉的胚珠离体培养途径成功获得了3个具有再生能力的胚状体，得出胚状体R2为单倍体。因此，本试验探究了基因型、取样时间、黑暗热激以及激素浓度等因素对西瓜未授粉子房离体诱导培养的影响，以期找到最佳的诱导条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

未授粉子房离体培养以‘早春红玉、‘西农9号和‘小绿皇3个西瓜品种为材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的准备及接种 自第2朵雌花开放开始，每天上午8：00左右取样。在无菌条件下用75%的酒精浸泡30 s，0.3%的次氯酸钠浸泡灭菌10 min，无菌水冲洗3次。然后将子房两端各切除约1 cm、刮去子房的表皮，将去皮后的子房横切成2 mm左右的薄片，平放在培养基中。每瓶接种子房片6～10块，每个处理接种3瓶，3次重复。

1.2.2 取样时间 分别取开花前2 d、开花前1 d和开花当天的子房作为试验材料，比较不同取样时间对诱导率的影响。培养基为MS+3.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA。

1.2.3 黑暗热激 以上述3种西瓜基因型品种的开花前1 d的子房作为材料，接种后的子房块置于33 ℃暗培养，热激时间设为3、4、5、6、7 d 5个水平。以25 ℃黑暗处理4 d 为对照。置光照条件下培养1周后，统计接种子房出胚数量。

1.2.4 西瓜未授粉子房的胚状体诱导培养基的筛选 先用1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA对2，4-D浓度进行筛选，2，4-D浓度设为2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg·L-16个处理水平。将选出的诱导率较高的2，4-D浓度与不同浓度的6-BA和NAA浓度进行组合试验比较，从而选出最佳激素浓度组合。NAA浓度为0.1、0.5 mg·L-1；6-BA浓度为0.5、1.0、2.0 mg·L-1。

1.2.5 西瓜未授粉子房的分化培养基 子房在诱导培养基上培养3周左右，产生明显的愈伤组织，将愈伤组织转移至诱导分化的培养基上继续进行诱导培养。分化培养基为：6-BA浓度设为0.2、0.5、1.0 mg·L-1 3个水平；NAA浓度设为0.1、0.2、0.5 mg·L-1 3个水平。每瓶接种有效愈伤2～3块，每个处理接种3瓶，3次重复。

1.2.6 倍性鉴定 采用染色体计数法确定再生植株的倍性。

1.3 数据统计与分析

雌核启动率/%=（出胚的子房片数量/总接种子房片数量）×100

芽点诱导率/%=（分化出芽点的愈伤数量/总接种子房片数量）×100

试验数据用Excel 和SPSS统计分析软件进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同基因型品种对西瓜未授粉子房诱导率的影响

基因型对西瓜未授粉子房的离体诱导培养有很大的影响，本试验所选的3个西瓜品种在相同培养条件下雌核启动率芽点诱导率差异很大，以‘早春红玉的芽点诱导率最高为22.2%，其次是‘西农9号的芽点率为10.8%，而‘小绿皇没有诱导出胚状体。但是最后仅‘早春红玉分化出了再生植株。因此，在相同的培养基及培养条件下，基因型不同，各品种的诱导效果也不同，这可能与品种的生理特性和抗逆性有关。

2.2 不同取样时间对西瓜未授粉子房诱导率的影响

西瓜未授粉子房的雌核启动率对取样时间适应范围比较广，虽然在不同取样时间上雌核启动率表现出不一致，但是各处理间的雌核启动率差异不大。从表1可知，‘早春红玉、‘ 西农9号和‘小绿皇的芽点率随取样时间的变化而变化，均以开花前1 d的子房芽点诱导率最高，分别为17.2%、16.1%和3.3%。这可能是开花前1 d的子房胚囊发育已接近成熟，对人工诱导较敏感。

2.3 黑暗热激对西瓜未授粉子房诱导率的影响

黑暗热激处理有利于启动雌核发育，子房片经过热激处理，胚珠开始从子房片中突起，在光照条件下培养1周左右转绿。而没有进行热激处理的出胚少，且转绿率低，最终没有芽点形成。由表2可知，‘早春红玉雌核启动率对热激处理不敏感，但是其芽点率受热激处理刺激较大，以处理4 d时芽点率最高为 14.8%。‘西农9号和‘小绿皇的雌核启动率在各处理间差异较大，分别以处理3 d和处理5 d的雌核启动率最高，但都与处理4 d无显著差异。二者的芽点率受热激处理影响不大，‘西农9号以处理3 d的芽点率最高为12.9%，其次是处理4 d的，‘小绿皇以处理4 d的芽点率最高为4.2%。综上所述，西瓜未授粉子房的培养以黑暗热激进行处理4 d的诱导效果最佳。

2.4 2，4-D浓度对西瓜未授粉子房诱导率的影响

2，4-D有利于胚性愈伤组织的形成，在一定范围内对2，4-D浓度进行筛选有利于提高未授粉子房的诱导率。本试验对6个2，4-D浓度进行了筛选，结果如表3。‘早春红玉以2，4-D浓度为3.0 mg·L-1时芽点率最高为20.0%，其次是3.5、4.0 mg·L-1。‘西农9号芽点率在3.0 mg·L-1时最高为22.2%，其次是5.0、4.0 mg·L-1。‘小绿皇对2，4-D浓度不敏感，在各处理间芽点率无显著差异，以2，4-D浓度为3.0 mg·L-1时芽点率最高为4.3%，其次是4.5、5.0 mg·L-1。在没有添加2，4-D的培养基上也能形成少部分愈伤，但有效愈伤获得率低。

2.5 激素组合对西瓜未授粉子房诱导率的影响

不同激素的组合有利于获得有效愈伤。因此，本试验采用‘早春红玉、‘西农9号和‘小绿皇3个西瓜品种对不同浓度的2，4-D、6-BA和NAA的组合进行了筛选，结果分别如表4、5和表6。‘早春红玉对激素的适应范围较广，以处理组合A的芽点率最高为15.0%。在只考虑2，4-D的浓度时，‘早春红玉以添加浓度为3.0 mg·L-1的2，4-D时诱导率最佳，但在激素组合中以添加4.0 mg·L-1 2，4-D的诱导率最高。可能是其他2种激素浓度限制了2，4-D的作用，所以筛选出的单个激素的最适浓度组合在一起不一定能得到最优组合。‘西农9号以处理组合a芽点率最高为15.0%。‘小绿皇只在培养基1上诱导出了芽点，芽点率为4.2%，在其他培养基上诱导率均为0。

2.6 分化培养基对西瓜未授粉子房诱导率的影响

将培养3周的子房转移至分化培养基上诱导分化，‘西农9号和‘小绿皇的芽点在培养后期均变褐化或者木栓化，没有分化潜力。只有‘早春红玉愈伤组织迅速膨大，最后在愈伤组织上长出芽点（图版1），培养一段时间后， 在培养基0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，0.5 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA和1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1NAA上分别获得了3个、1个、1个丛生芽（图版-2）。但培养基1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1 NAA上分化的丛生芽生长畸形，可能是激素浓度不适宜的原因。

2.7 再生植株的倍性鉴定

本试验获得再生植株生根缓慢，只得到极少数根系。只对丛生芽进行了染色体鉴定发现有9～10条、20～22条和36～40条染色体（图版-3），还没有完成对完整植株进行鉴定。因有籽西瓜是二倍体作物，且体细胞染色体数是22条，所以本试验将所获得的再生植株的倍性应该为单倍体、二倍体和四倍体。

2.8 再生植株的分化情况

再生植株的分化有以下5种情况（图版-4）：（A）芽分化正常，但是无论怎么诱导都不能长出根系，形成只有茎和叶片的植株；（B）芽分化缓慢甚至畸形，形成的植株矮小，根系发达，最终也不能伸长；（C）只长出2片叶子，但是没有分化出生长点；（D）愈伤组织的一端形成芽，另一端形成根。（E、F）先分化出茎叶，培养一段时间后长出根系，形成完整植株。这可能受生长素/细胞分裂素的比例影响，比例过高，先生根，再长芽，然后形成完整植株。比例过低，先分化出芽，再发展成完整的植株。因此，还需要对激素配比进行研究，找出最佳的激素浓度。

3 讨 论

3.1 黑暗热激处理对西瓜未授粉子房雌核启动的影响

黑暗热激有利于未授粉子房的雌核启动，许多研究均表明35 ℃或者30 ℃热激效果最好[4-5]。本试验没有对热激温度进行筛选，直接选用33 ℃进行黑暗热激处理，经处理的子房由白转为黄绿色，并且胚珠已开始突起，未经热激处理的子房均不能分化出芽点和胚状体，以热激处理4 d的子房雌核启动率和芽点率最高。

3.2 基因型对西瓜未授粉子房离体培养诱导率的影响

在相同条件下，不同基因型品种的诱导率不一样[6]。迟世春等[7]在甜菜上接种13份材料，其中1份未形成胚状体，其余材料的诱导率为1.7%～16.3%。本试验在未授粉子房离体培养中采用基因型不同的3个西瓜品种作为试验材料，仅‘早春红玉获得了再生植株。说明基因型是西瓜未授粉子房成功诱导的重要因素，所以还应根据需要扩大基因型的选择范围，以期筛选出容易诱导分化出完整植株的基因型。

3.3 胚囊发育时期对西瓜未授粉子房诱导率的影响

葛志东[2]在西葫芦未授粉子房培养中发现胚珠发育程度决定了诱导率的高低，并以接近成熟的开花前1 d的子房诱导效果最好。Tarek A[8]在西葫芦上得出第2节位的雌花诱导率高于第1和第3节位的雌花。本试验从第2朵雌花开放时开始取样，发现所采用的3个品种均以开花前1 d的子房诱导率最高。但是周林[9]在研究中认为西瓜开花当天的子房诱导率最高，这与本试验结果有一定的差异。可能是不同基因型品种的子房胚囊发育程度、生理状况和内源激素水平不一致所造成的。

3.4 外源激素对西瓜未授粉子房离体培养的影响

有研究表明，外源激素对未授粉子房的离体培养影响很大，且发现2，4-D是胚性愈伤组织形成所必需的[10]。葛志东[2]在西葫芦研究中发现2，4-D、6-BA、NAA混合使用比单独使用某种激素诱导率高。本试验也得出激素是未授粉子房离体培养必不可少的，在没添加激素的培养基上3个供试品种都没有获得芽点。2，4-D对西瓜未授粉子房的诱导非常重要，其浓度决定了诱导率的高低。但在只添加2，4-D的培养基上，愈伤不分化，不能获得芽点。所以一定浓度的6-BA和NAA也是西瓜未授粉子房培养所需要的。

3.5 再生植株倍性探讨

许多研究者都采用染色体计数法进行了植株的倍性鉴定[11-12]，本试验利用染色体计数法鉴定再生植株发现有单倍体、二倍体和四倍体，这与迟世春[7]在甜菜研究中所得到的结果一致。可能是单倍体在培养过程中自然加倍的结果，也可能是由珠被或者子房壁获得的再生植株。因此，在未授粉子房离体培养中，如何防止体细胞产生植株是单倍体诱导的一大关键。

参考文献

[1] 杜胜利. 黄瓜雌核发育及染色体倍性鉴定与加倍研究 [D]. 天津：南开大学，2002.

[2] 葛志东. 西葫芦未授粉子房离体培养研究[D]. 乌鲁木齐：新疆农业大学，2009.

[3] 杨 颖. 西瓜离体雌核发育诱导单倍体与甜瓜SSR标记图谱构建[D]. 银川：宁夏大学，2010.

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[7] 迟世春，卞桂杰，王景波，等. 甜菜未授粉胚珠培养技术研究[J]. 中国甜菜，1993（3）： 1-6.

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