利用SRAP标记分析春兰种质资源遗传多样性

牛田等

摘 要：利用SRAP分子标记对42份春兰品种及1份多花兰、1份春剑及3份杂交兰进行遗传多样性分析。筛选出的15对引物组合共扩增出185个位点，其中多态性位点184个，平均每对引物组合产生12.27个多态性位点。引物组合Me8-Em16的Neis基因多样性数H（0.3993）、Shannon信息指数I值（0.5794）和有效等位基因数Ne（1.7280）都是最高值。47份材料的遗传相似系数变化范围为0.63～0.80，UPGMA聚类分析表明，在遗传相似系数为0.662处，将47份材料划分成5个类群。本研究较好地揭示了47份材料亲缘关系的远近，为春兰各品种间的分类和杂交亲本的选择提供重要理论依据。

关键词：春兰；SRAP；遗传多样性；聚类分析；亲缘关系

中图分类号：S311 文献标志码：A 论文编号：2013-1027

Genetic Diversity Analysis of Cymbidium goeringii 's Germplasm Resources Based on SRAP Markers

Niu Tian1， Zhang Lin2， Wang Houxin2， Li Chengxiu2， Nie Shuo1， Zhu Cuicui1， Wang Changxian2

（1College of Forestry， Shandong Agriculture University， Taian 271018， Shandong， China；

2Taishan Forestry Academe， Taian 271000， Shandong， China）

Abstract： SRAP was used to analyse the genetic diversity analysis of 42 Cymbidium goeringii cultivars and 1 specie of Cymbidium floribundum， 1 specie of Cymbidum longibracteatum and 3 species of hybrid Cymbidium. 15 polymorphic primer combinations were screened and a total of 185 DNA loci were amplified，184 of which were polymorphic. The average number of polymorphic DNA loci amplified by each primer was 12.27. Primer combination Me8-Em16s Neis genetic diversity index （0.3993）， Shannon's information index （0.5794） and Effective number of alleles （1.7280） were the highest. The genetic similarity among 47 germplasm ranged from 0.63-0.80. The UPGMA clustering showed that all the tested cultivars and species were classified into five cluster groups with the similarity coeficient of 0.662. The study were well revealed the 47 materials genetic relatives. The findings of this study would provide an important theoretical basis for Cymbidium goeringii classification and parental selection in cross breeding.

Key words： Cymbidium goeringii； SRAP； Genetic Diversity； Cluster Analysis； Genetic Relationship

0 引言

春蘭（Cymbidium goeringii）属于兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium），别名朵朵香、草兰、草素、山花等，地生兰原种，室内观赏盆栽花卉。在中国江浙地区分布较广，福建、广东、四川、云南、安徽、江西、台湾等地亦有出产，有肉质根及球状的拟球茎，叶丛生而刚韧，狭长而尖，边缘粗糙；假鳞茎稍呈球形，叶4～6枚集生，狭带形，边缘有细锯齿；花单生，少数2朵，花葶直立，花期2—3月。兰花是中国十大传统名花之一，距今已有2500多年的栽培历史。其味清幽，花色淡雅，具有较高的观赏价值。

随着分子生物学技术的不断发展，DNA分子标记技术已经逐渐应用到春兰的鉴定中。目前应用于春兰分子标记的主要为RAPD、AFLP、ISSR等。季祥彪等[1]采用RAPD标记对贵州野生春兰遗传多样性进行分析；陈慧云等[2]利用AFLP分子标记对部分春兰名品进行了DNA指纹图谱分析；春兰ISSR-PCR反应体系的优化也已见报道[3]。但SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性）是由Li等[4]开发的一种新型的PCR分子标记技术，它针对基因外显子里GC含量丰富而启动子和内含子里AT含量丰富的特点来设计引物进行扩增，因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性，具有操作简便、稳定可靠、共显性高、重复性高、易于分离条带及测序的特点[5]，在基因组中分布均匀，但是同样易受到反应条件和扩增程序变化的影响。目前SRAP主要应用于植物种质资源鉴定评价、种缘进化关系、遗传图谱构建、基因定位、重要性状标记以及比较基因组学等方面。目前关于利用SRAP分子标记进行遗传多样性分析的文章未见报道，本研究利用SRAP分子标记对42份春兰品种及1份多花兰、1份春剑及3份杂交兰进行遗传多样性分析，拟为春兰各品种间的分类和杂交亲本的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为山东省泰安市泰山林业科学研究院生物技术中心提供的42个春兰不同品种及作为对照材料的1份多花兰、1份春剑及3种杂交兰，其品种名及编号详见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 取幼嫩叶片用硅胶干燥，采用改良的CTAB法[6]提取基因组DNA，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。所有DNA样品稀释至50 ng/μL，于-20℃冰箱内保存备用。

1.2.2 SRAP-PCR扩增 采用筛选优化后的SRAP-PCR体系（25 μL），包括超纯水14.5 μL，buffer缓冲液2.5 μL，Mg2+浓度2.5 mmol/L，引物浓度为1.2 μmol/L，dNTP浓度2 mmol/L，Taq聚合酶0.5 U，DNA模板为90 ng。扩增程序为：94℃预变性4 min，反应前5个循环为94℃变性1 min、35℃复性1 min、72℃延伸1 min；后30个循环退火温度50℃，72℃延伸50 s；循环结束后再72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR产物检测 PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶電泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，电压120 V。凝胶经溴化乙锭（EB）染色后置于凝胶成像系统上采集图像。

1.2.4 数据统计与分析 扩增条带中只统计清晰、易于辨认的条带，结果采用二元性状编码，即有带表示为1，无带表示为0[7-9]。采用POPGENE1.32软件计算每对SRAP引物的多态性位点数和多态位点百分率，Nei遗传多样性指数H和Shannon信息指数I，并利用NTSYS 2.10e软件根据Nei遗传相似系数采用UPGMA（未加权平均法）进行聚类[10-12]，并绘出聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

本试验所用的正反向引物序列见表2，从170对引物组合中筛选出条带清晰稳定、多态性好的引物15对。对47份兰花种质材料进行PCR扩增（图1、图2），扩增结果表明，筛选出的不同引物组合扩增出的DNA片段长度在250～5000 bp。15对引物组合在47份材料中共检测到185个位点，其中多态性位点184个，多态性比率达99.46%，平均每对引物组合产生12.27个多态性位点。其中引物组合Me6-Em4多态性比率最低为90%；Me8-Em16的Neis基因多样性数（0.3993）、Shannon信息指数（0.5794）和有效等位基因数（1.7280）都是最高值。

2.2 聚类分析

根据筛选出的15对多态性引物扩增结果，采用UPGMA法进行聚类分析（图3），得出春兰种质资源的亲缘关系树状图，结果显示47份兰花种质资源的遗传相似系数为0.63～0.80。其中3组品种组合的遗传相似系数（0.80）最大，分别是同样来自于浙江绍兴的奇花类牡丹瓣的‘天彭牡丹和‘锦绣中华，‘金汪字和‘新梅以及同样来自于四川成都的梅瓣类的‘绿梅和‘黄梅。在遗传相似系数为0.662处，将47份材料划分成5个类群，第Ⅰ类群又在遗传相似系数为0.67处，划分为两大亚类群；第Ⅱ类群都属于“春兰老八种”，分别是瓣型为水仙瓣的3号‘汪字和瓣型为梅瓣的7号‘万字；第III类群为瓣型为荷瓣的5号‘环球荷鼎；第IV类群为瓣型为多瓣的18号‘四喜蝶；第Ⅴ类群又在遗传相似系数为0.691处，划分为2个亚类群，其中45号春剑品种‘隆昌素和47号蕙兰品种为一类；40号多花兰品种和46号多花兰与蕙兰杂交品种为一类，二者表现出较近的亲缘关系，主要是46号杂交品种的父母本有一个是多花兰品种，这与聚类分析结果基本一致。

聚类分析结果表明，来自于相同地区的春兰品种的亲缘关系较近，如在第Ⅰ类群划分的第2亚类群中，来自于四川成都的38号‘绿梅、41号‘大富贵、42号‘宋梅、43号‘黄梅和44号‘集圆归为一类，同时与来自于浙江绍兴的47号‘新梅正好分开，47号单独为一类；但也存在着来源于不同地区的品种亲缘关系较近的现象，同样在在第Ⅰ类群划分的第2亚类群中，来自于四川成都的36号‘簪梅与来自于浙江绍兴的27号‘红宋梅亲缘关系较近，划分为一类，说明不同地区的春兰品种之间的遗传距离差距虽然比较远，但由于各地之间兰花市场的交易频繁以及经过人工驯化，来源于不同地区的优良品种间的杂交现象还是存在的。

3 结论

本研究利用筛选出的15对特异性引物组合扩增出185个位点，其中多态性位点184个，多态性比率达99.46%，而朱根发等[13]对大花蕙兰种质进行AFLP分析时，64对引物中筛选出多态性引物9对，多态性引物比率仅为14.1%。李冬梅等[14]利用RAPD标记分析了大花蕙兰种质资源亲缘关系，100个引物中筛选出20个引物，引物多态性百分率也仅有20%。陈惠云等[2]利用AFLP分子标记技术对18种名贵春兰品种进行了DNA指纹图谱分析，筛选出16对引物，共扩增出345条带，其中有多态性带169条，多态性百分率为48.99%。李钧敏等[15]利用RAPD分子标记技术对30个西兰花栽培新品种进行分析，结果显示22个特异引物共扩增出229条谱带，其中多态性条带有109条，多态性带比例仅为47.60%。由此可知，SRAP多态性较好，效率也很高，可以提供更丰富的遗传信息，获得更可靠的结果。同时本研究所得的结果表明SRAP在春兰种质遗传多样性研究中具有高效性，同时47份材料具有较丰富的遗传多样性。

利用SRAP分子标记技术对不同植物扩增结果也是有所不同的，而且效率也是不相同的。欧阳冬梅等[16]利用SRAP标记对来自国内外莲属40份材料进行分析。11对特异性引物共扩增了184条条带，多态性条带127条，多态性带比例为69.0%。文雁成等[17]采用SRAP标记对建国以来不同时期选育的130个品种进行分析，25个SRAP引物组合共扩增到509个谱带，其中123个多态性条带，多态性带百分率为24%。赵秀娟等[18]从144对SRAP引物中筛选出61对多态性强、重复性好的SRAP引物，对43份苦瓜种质DNA进行了扩增，共得到2078条谱带，其中多态性谱带863条，多态性带比例为42.11%。以上差异可能与不同植物所具有的基因组不同及所筛选的引物组合不同有关。SRAP在春兰遗传多样性上表现出高效性，将为春兰亲缘关系鉴定方面提供重要技术支撑。

4 讨论

从聚类分析树状图可以看出，47份兰花种质资源的遗传相似系数为0.63～0.80，各品种间表现出较高的亲缘关系；春兰品种与作为对照的非春兰品种蕙兰、多花兰和春剑等遗传相似系数（0.63）最小，表现的亲缘关系最远，这与严华[19]对不同种国兰亲缘关系的ISSR分析结果基本一致。47份材料在表型性状中也表现出较高的多样性，从叶色、叶形、叶姿、花色、瓣型等都表现出很大差异，而其中遗传相似系数最大（0.80）的2个品种‘天彭牡丹和‘锦绣中华在形态学上也表现出一致性：叶片较长，叶夹角较大，叶姿较直立，叶片为浅绿色，瓣型为奇花类牡丹瓣。但瓣型为水仙瓣的3号‘汪字和梅瓣的7号‘万字同属于第Ⅱ类群，这与兰花传统瓣型分类存在差异，二者的分类仍有待于进一步研究。

在形态学分类上，春兰品种主要依据株型、花瓣、花色、叶型、叶艺等形态特征进行区分，有一定的局限性。有关研究报道，在兰科植物中，如果其他基因插入到控制花颜色的基因中，会导致花颜色的改变[20]。因此，针对内含子和启动子区域AT含量丰富而与间隔区长度不等而进行特异扩增的SRAP分子标记技术能够比传统的形态学分类更为有效地鉴定出春兰各品种间的亲缘关系。

由于整个兰花市场需求量的不断加大，兰花交易额也随之递增。目前市场上春兰等国兰的价格飙升，导致农民上山大量采挖兰花野生资源，许多春兰的名品破坏严重，野生资源变得越来越稀缺，因此春兰种质资源的开发与保护显得尤为重要。本研究结果表明不同来源地的绝大部分春兰品种之间的亲缘关系距离较远，因此，地方对春兰品种种质资源的保护对保持当地春兰品种丰富的遗传多样性具有重要作用。本研究较好地揭示了春兰各品种之间的亲缘关系，但由于技术有一定的局限性，在随后的工作中将结合其他手段和技术对其做进一步的探索，为春兰种质资源的利用与保护奠定更坚实的基础。

参考文献

[1] 季祥彪，王国鼎，乔光，等.贵州野生春兰遗传多样性的RAPD分析[J].华中农业大学学报，2008.2（27） 297-302.

[2] 陈惠云，孙志栋，孙日飞，等.AFLP分子标记技术在名贵春兰鉴别中的应用[J].农业生物技术科学，2007，2（2）-23.

[3] 马丽娅，孙小琴，贾文杰，等.春兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化[J].安徽农业科学，2008，36（34）：14912-14914.

[4] Li G， Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP）， a newmarker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet，2001，103：455-461.

[5] 张飞，陈发棣，房伟民，等.菊花SRAP-PCR反应体系的优化与确立[J].植物资源与环境学报，2009，18（3）：44-49.

[6] 李永明，赵玉琪.实用分子生物学方法手册[M].北京：科学出版社，2001：173-178.

[7] 刘丹，孙健，马殿荣，等. 利用SRAP分子标记分析47份杂草稻样品遗传多样性[J].中国水稻科学，2012，26（1）：70-76.

[8] 李达，张宏志，龙岳林，等.兰属SRAP-PCR反应体系的建立与优化[J].亚热带植物科学，2012，41（3）：21-24.

[9] Gao L Z， Schaal B A， Zhang C. Assessment of population genetic structure in common wild rice（ Oryza rufipogon Griff） using microsatellite and allozyme markers[J].Theor Appl Genet，2002，106： 173-180.

[10] Liu L W， Zhao L P， Gong Y Q， et al. DNA fingerprinting and genetic diversity analysis of late-bolting radish cultivars with RAPD，ISSR and SRAP markers [J].Sci Hort，2008，116： 240-247.

[11] Qian W， Ge S， Hang D Y. Genetic variation within and among population of a wild rice Oryza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers [J]. Theor Appl Genet，2001，102：440-449.

[12] 马红勃，赖鋆英，许旭明，等.基于SRAP标记的大花蕙兰种质资源遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报，2011，12（4）：551-556.

[13] 朱根发，李冬梅，郭振飞，等.大花蕙兰遗传多样性及亲缘关系的AFLP分析[J].园艺学报，2007，34（2）：417-424.

[14] 李冬梅，叶庆生，朱根发.大花蕙兰种质资源亲缘关系的RAPD分析[J].中国农业科学，2007，40（4）：800-806.

[15] 李钧敏，金则新，柯喜丹.西兰花品种的随机扩增多态DNA分析[J].江苏农业科学，2006，1（4）：66-70.

[16] 欧阳冬梅，游永宁，刘凰，等.莲品种SRAP指纹图谱的构建及遗传多样性分析[J].現代园艺，2013，2（2）：22-25.

[17] 文雁成，王汉中，沈金雄，等.用SRAP标记分析中国甘蓝型油菜品种的遗传多样性和遗传基础[J].中国农业科学2006，39（2）：246-256.

[18] 赵秀娟，宋建文，胡开林.苦瓜种质遗传多样性的SRAP标记分析[J].植物遗传资源学报2013，14（1）：78-84.

[19] 严华，张冬梅，罗玉兰，等. 38种国兰亲缘关系的ISSR分析[J].分子植物育种， 2010，8（4）：736-741.

[20] Hieber A D， Mudalige-Jayawickrama R G， Kuehnle A R. Colorgenes in the orchid oncidium gower ramsey： identification， expression， and potential genetic instability in an inter specific cross [J]. Planta，2006，223：521-531.