4种鱼肉的基本成分及胶原蛋白含量分析

张延华　马国红　宋理平　冒树泉　吴君

摘 要：通过测定鲈鱼（Lateolabrax japonicas）、鮻鱼（Liza haematocheila）、草鱼（Ctencpharyngodon idellus）和鲤鱼（Cyprinus carpio）的背部肌肉基本成分及羟脯氨酸的含量，对其胶原蛋白含量进行分析。结果显示：4种鱼肉中粗蛋白含量分别为18.23%、19.82%、16.18%、17.07%；胶原蛋白的特征性氨基酸羟脯氨酸含量分别为0.0574%、0.0646%、0.0781%、0.0743%，胶原蛋白含量分别为0.6371%、0.7159%、0.8669%、0.8247%。结果表明：仅从蛋白质含量来看，鱼肉是一種很好的蛋白质来源，并且海水鱼优于淡水鱼。但鱼肉中胶原蛋白含量很低，表明鱼肉不适合作为胶原蛋白的提取原料。

关键词：鱼肉；营养成分；羟脯氨酸；胶原蛋白；比色法

中图分类号：S985.1 文献标志码：A 论文编号：2013-0882

0 引言

胶原蛋白又称胶原，是动物体内结缔组织的重要组成成分，约占其体内总蛋白质含量的1/4[1]。胶原蛋白含有丰富的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸。羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）是胶原蛋白的特征性氨基酸，通过测定羟脯氨酸的含量，然后乘以相应的系数就可以得到胶原蛋白的含量。羟脯氨酸的测定包括比色法、氨基酸分析仪法和HPLC法、电泳法等，以比色法最为常用[2]。

提取胶原蛋白的传统原料主要是陆生哺乳动物，如猪、牛的皮和骨。由于近年来哺乳动物疫病的爆发和人畜共患病的增加，世界各国都在积极寻找新的胶原蛋白来源，同时渔业养殖的大规模发展使水产胶原蛋白替代哺乳动物成为可能。不少学者对鱼类组织中的羟脯氨酸进行测定，为寻找新的胶原蛋白原料提供理论依据。张俊杰[3]曾用比色法测定鱼鳞中羟脯氨酸；胡建平[4]对鱼骨中的羟脯氨酸进行过测定，鱼皮中的羟脯氨酸含量也有过报道，但鱼肉中羟脯氨酸的含量却鲜有报道。本研究分别选取2种海水鱼鲈鱼、鮻鱼，2种淡水鱼草鱼、鲤鱼作为研究对象，拟对其鱼肉中的羟脯氨酸含量用比色法进行测定，以期为充分开发鱼体组织中的胶原蛋白提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鲈鱼、鮻鱼、草鱼、鲤鱼均购自济南市某水产品市场，鱼体健康无病，体重1 kg左右。冰块保存运至实验室，每尾鱼分别取背部的肌肉（由于受生长环境、营养条件、鱼体大小等因素的影响，鱼体不同部位肌肉所测得的结果会有差异。就同种鱼类来说，鱼体背部肌肉的营养成分相对比较稳定。为了便于取样和比较，本研究中的采样统一取背部肌肉即自鱼体两侧鳃盖骨后至尾鳍前取体背部肌肉作为样品进行测定），用刀将肉在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5 cm3，边长约为 8 mm），置于-20℃冰箱保存备用，一部分用于常规营养成分测定，一部分用于羟脯氨酸的测定。

1.2 常规营养成分测定

水分含量测定采用105℃烘干失水法[5]，粗蛋白测定采用微量凯式定氮仪法[6]，粗脂肪测定采用索氏抽提法[7]，灰分测定采用550℃干法灰化法[8]。

1.3 羟脯氨酸含量的测定[9]

1.3.1 基本原理 用硫酸于105℃水解试样，过滤、稀释水解产物。羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558 nm处进行比色测定。

1.3.2 试剂配制

①硫酸溶液[c（H2SO4）≈3 mol/L]：量取750 mL水于2 L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320 mL浓硫酸。冷却至室温后用水定容。

②缓冲溶液（pH=6.8）：26.0 g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O），14.0 g氢氧化钠，78.0 g无水乙酸钠[Na（CH3CO2）]，用500 mL水溶解上述试剂并转入1 L的容量瓶中，加入250 mL正丙醇，用水定容。该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。

③氯胺T溶液：称取1.41 g氯胺T，用100 mL缓冲溶液溶解。临用前配制。

④显色剂：称取10.0 g对二甲氨基苯甲醛，用 35 mL高氯酸溶液[60%（质量分数）]溶解，缓慢加入 65 mL异丙醇。临用前配制。

⑤羟脯氨酸标准储备液：称取50.0 mg羟脯氨酸标准品于100 mL容量瓶中，用水溶解，加一滴3 mol/L硫酸溶液，用水定容至刻度。该溶液在4℃下能稳定存放1个月。

⑥羟脯氨酸标准工作液：移取5.00 mL上述标准储备液于250 mL容量瓶中，用水定容。分别吸取该溶液10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度依次为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ?g/mL。临用前配制。

1.3.3 仪器和设备 电热干燥箱、电热恒温水浴锅、721-分光光度计（可用波长558 nm±2 nm）、电子天平、容量瓶、表面皿、比色皿、平底烧瓶、圆形滤纸、不透明塑料薄膜、pH计等。

1.3.4 测定步骤

（1）标准曲线的绘制。分别移取4.00 mL羟脯氨酸标准工作液于比色管中，加入2.00 mL氯胺试剂，混合后于室温下放置（20±1） min。加入2.00 mL显色剂于比色管中，充分混合，用塑料薄膜将比色管封口，迅速放入60℃水浴中，加热20 min。取出比色管，用流动水冷却比色管至少3 min ，在室温下放置 30 min。用水作参比，于（558±2） nm处用分光光度计测定吸收值。

以扣除了空白的标准工作液的吸光度为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（2）羟脯氨酸含量的测定。①试样制备。将切好的试样装入耐热塑料袋中，70℃以上保温30 min后，冷却。用绞肉机将试样均质。将试样装入密封的容器中，防止变质和成分变化。试样应在均质后24 h内尽快分析。在待测试样保存、制备、称重过程中，试样需混合均匀，特别是脂肪和液体要保持均匀。②水解。称取4 g试样（精确至0.001 g）于烧瓶中，避免试样粘在烧瓶壁上。量取（30±1） mL硫酸溶液，加入烧瓶中，用表面皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16 h。用圆形滤纸趁热将水解产物过滤至250 mL容量瓶中。用10 mL硫酸溶液分3次洗涤烧瓶和滤纸，合并至上述容量瓶中。用水定容，摇匀。③测定。用移液管移取一定体积（V）的水解产物至250 mL容量瓶中，定容后羟脯氨酸的浓度在0.5～2 ?g/mL之间。移取4.00 mL上述溶液于比色管中，加入2.00 mL氯胺 试剂，混合后于室温下放置（20±1） min。加入2.00 mL显色剂于比色管中，充分混合，用塑料薄膜将比色管封口，迅速放入60℃水浴中，加热20 min。取出比色管，用流动水冷却比色管至少3 min ，在室温下放置30 min。用水作参比，于（558±2） nm处用分光光度计测定吸收值。

扣除空白溶液的吸收，从所得标准曲线查得水解产物中羟脯氨酸的含量。

试样中羟脯氨酸的含量按式（1）计算。

X=6.25c/（m×V）…（1）

式中：X：试样中羟脯氨酸的含量，%；c：由标准曲线得到的试样溶液中羟脯氨酸的浓度，单位为微克每毫升（?g/mL）；m：试样质量，单位为克（g）；V：从250 mL容量瓶中吸取滤液的体积，单位为毫升（mL）。

2 结果与分析

2.1 常规营养成分含量

本实验所测得的4种鱼肉基本营养成分见表1。可以看出，几种鱼肉中都含有大量的水分，其中鲈鱼、草鱼都在78%以上，4种鱼肉中干物质分别占21.6%、23.95%、21.23%、25.68%，在这些干物质中大部分为蛋白质，分别占干物质总量的84.41%、82.75%、76.22%、66.48%，海水鱼>淡水鱼。因此，仅从蛋白质含量来说，鱼肉是一种很好的蛋白质来源，并且海水鱼优于淡水鱼。四种鱼肉中鲤鱼的脂肪含量最高，鲈鱼、鮻鱼相差不大，灰分含量鲈鱼>鮻鱼>草鱼>鲤鱼。

2.2 羟脯氨酸标准曲线的绘制

按照“1.3.4”中（1）的方法，测定标准曲线，羟脯氨酸标准样品的质量浓度和吸光度如表2所示。

以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算其回归方程为：y=0.1692x+0.0018，相关系数R2=0.9856，因此，吸光度和羟脯氨酸浓度之间有很好的相关性，标准曲线见图1。

2.3 肉样羟脯氨酸及胶原蛋白含量

将四种鱼的肌肉样品（每种鱼肉样设3个平行），测定吸光度并计算Hyp浓度，结果见表3。

由表3可见，4种鱼肉中羟脯氨酸含量分别为0.0574%、0.0646%、0.0781%、0.0743%，胶原蛋白含量分别为0.6371%、0.7159%、0.8669%、0.8247%。其中，草鱼、鲤鱼之间无显著性差异，鲈鱼、鮻鱼之间有显著性差异，海水鱼胶原蛋白含量低于淡水鱼。

3 讨论

本研究对2种海水鱼鲈鱼、鮻鱼，2种淡水鱼草鱼、鲤鱼的基本成分及胶原蛋白含量进行了分析。结果显示：4种鱼肉中干物质分别占21.6%、23.95%、21.23%、25.68%，在这些干物质中大部分为蛋白质，分别占干物质总量的84.41%、82.75%、76.22%、66.48%。蛋白质是评价鱼肉营养价值的重要指标，因此，仅从蛋白质含量来看，鱼肉是一种很好的蛋白质来源，并且海水鱼优于淡水鱼。

通过本试验测定得知，鲈鱼、鮻鱼、草鱼、鲤鱼肌肉中羟脯氨酸含量分别为0.0574%、0.0646%、0.0781%、0.0743%。由于羟脯氨酸含量稳定，在其他蛋白中很少见，为胶原蛋白所特有，所以可以通过测定它来推算胶原蛋白的含量，据文献，一般水产动物多采用11.1的换算系数[10]，据此推算，鲈鱼、鮻鱼、草鱼、鲤鱼的鱼肉胶原蛋白含量分别为0.6371%、0.7159%、0.8669%和0.8247%，分别占鱼肉总蛋白含量的3.49%、3.61%、5.36%、4.83%。说明在鱼肉中胶原蛋白含量很低，并且海水鱼低于淡水鱼。

根据文献，鱼皮中的羟脯氨酸含量鳕鱼皮（1.34%）[11]、军曹鱼皮[12]（1.81%）、罗非鱼皮[12]（1.86%）、金枪鱼皮[12]（2.04%）；魚鳞中的羟脯氨酸含量美国红鱼[13] （1.49%），大黄鱼[13]（1.16%），鲤鱼[14]（1.37%）均远高于本试验中鱼肉的羟脯氨酸，鱼皮、鱼鳞中的胶原蛋白均可占其粗蛋白含量的70%左右，可见鱼皮、鱼鳞中的蛋白质主要是胶原蛋白，可以作为提取胶原蛋白的原料。

本试验4种鱼肉中的羟脯氨酸含量远低于鱼皮、鱼鳞，表明鱼体组织中鱼肉的胶原蛋白含量很低，不适合作为胶原蛋白提取的原料。

另外，不少研究证明，肌肉的柔嫩与老化主要决定于肌内结缔组织中胶原蛋白的含量并且肌肉结缔组织含量越少、肉越细嫩，含量越多则肉越粗老。即肌肉中羟脯氨酸含量与肌肉嫩度之间存在明显的负相关。在猪肉[15]、鸡肉[16]中此结论已经得到证实，在本试验中，四种鱼肉的羟脯氨酸含量中鲈鱼<鮻鱼<鲤鱼<草鱼，按照该结论，鲈鱼肉最细嫩，草鱼肉最粗老，似乎与人们对不同鱼肉的喜好相符合。但鱼肉中的羟脯氨酸含量是否是评价鱼肉品质的指标尚需进行进一步的研究探讨。

4 结论

本研究通过对4种鱼肉的基本成分及羟脯氨酸含量的测定，分析了鱼肉中胶原蛋白的含量，结果表明仅从蛋白质含量来看，鱼肉是一种很好的蛋白质来源，并且海水鱼优于淡水鱼。但鱼肉中胶原蛋白含量很低，表明鱼肉不适合作为胶原蛋白的提取原料。而鱼肉中的羟脯氨酸含量是否可作为评价鱼肉品质的指标尚需进一步的研究探讨。

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