红松种鳞多酚的二次纯化工艺及其抗氧化性的研究

符群 徐明慧 王振宇

摘要

[目的]为了验证红松种鳞多酚二次纯化及抗氧化特性。[方法]采用聚酰胺层析柱法对经AB8树脂纯化后的红松种鳞多酚纯化液进行二次纯化，并且测定其DPPH自由基清除率、总还原能力。[结果]通过正交试验分析，得到聚酰胺二次纯化的最优条件为：聚酰胺树脂30～60目、上样pH 5、吸附时间1 h、洗脱液为乙醇、上样量2 BV、洗脱浓度70%、洗脱pH 7。在此工艺下，多酚的纯度可达62%±2%。二次纯化后的多酚清除DPPH自由基的IC50值为10.94 μg/ml，总还原能力与VC的相似且略高于一次纯化的多酚液。[结论]红松种鳞二次纯化多酚纯度约为一次纯化多酚的2倍，且具有抗氧化特性。

关键词 红松；多酚；二次纯化；抗氧化

中图分类号 S791.247 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）26-08879-05

Korean Pine Species of Scale Secondary Purification Process of Polyphenols and Oxidation Resistance

FU Qun， WANG Zhenyu et al

（School of Forestry， Northeast Forestry University， Herbin， Heilongjiang 150040； School of Food Science and Engineering， Herbin Institute of Technology， Herbin， Heilongjiang 150001）

Abstract [Objective]The research aimed to test and verify secondary purification and antioxidant properties of Korean pine scale polyphenols. [Method]By polyamide column chromatography method for AB8 resin purification of Korean pine scale polyphenols， liquid after secondary purification was purified， and DPPH free radical clearance rate and the total reducing power were determined. [Result] Polyamide was obtained by the orthogonal experiment analysis. The optimal conditions for secondary purification was as follows： 30 to 60 mesh polyamide resin， sample pH 5， adsorption time1 h， eluent for ethanol 2 BV on sample amount， elution concentration 70%， elution pH 7. In this process， the purity of polyphenols was up to 62%±2%. IC50 value of secondary purified polyphenols removal DPPH free radical was 10.94 μg/ml， total reducing power was similar to VC and slightly higher than the fluid of a purified polyphenols. [Conclusion] Korean pine species of scale secondary purified polyphenols purity was about 2 times a purified polyphenols， and had antioxidant properties.

Key words Korean pine；Polyphenols；Secondary purification；Antioxidant activity

隨着社会的持续发展，人们生活节奏的加快，环境污染日益严重，人们的患病几率大幅度增加。郑晶泉^[1]在抗氧化剂抗氧化试验研究进展中提到，大多数疾病的发生均与自由基有关，如衰老、心脑血管病、类风湿、癌症、帕金森症、关节炎等。多数研究表明，抗氧化物质可以有效地抵消自由基对人体造成的损伤^[2]。因此，人们对抗氧化剂的关注度不断加强。目前合成的食品抗氧化剂已被广泛应用于食品的生产、保藏，同时人们对这类合成抗氧化剂毒副作用堪忧^[3]。因此，从天然食材中寻找安全的天然抗氧化物质成为了研究热点。天然抗氧化剂主要来源于植物多酚。而Petkovsek等^[4]研究表明，多酚的抗氧化特性与其含量、种类有关。

聚酰胺是一类通过聚酰胺基聚合而成的高分子化合物^[5]。其物理性质较稳定，操作方便，可循环利用，成本较低，污染较小，因此在分离纯化多酚类、黄酮类、汞、醌等物质上被广泛运用。杨武英等^[6]通过聚酰胺精纯得到纯度为81.34%的青钱柳黄酮，纯度比粗提品提高6.14倍，且黄酮含量高，具有安全性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红松种鳞采自长白山；聚酰胺，购自浙江省台州市路桥四甲生化塑料；DPPH（ALDrich公司）；无水乙醇，购自天津市东丽区天大化学试剂。

1.2 试验方法

1.2.1

红松种鳞多酚一次纯化液的制备。称取一定量的红松种鳞粉末，在40 ℃条件下按照料液比1∶30以浓度50%无水乙醇为浸提溶剂进行水浴提取。经旋转蒸发除去乙醇的多酚粗提物，采用AB8大孔树脂进行纯化（多酚纯度达到42%）。纯化液经旋转蒸发去除无水乙醇后，4 ℃冷藏保存，备用。

1.2.2

标准曲线。采用FolinCiocalteus法^[7]，测定总多酚含量。以没食子酸为标准，对照计算样品中多酚含量，标准曲线方程为y=0.011 6x+0.041，R2=0.999 5，其中y表示吸光值，x表示没食子酸含量（μg/ml）。

1.2.3

红松种鳞多酚二次纯化。

1.2.3.1

二次纯化静态试验。

（1）不同型号聚酰胺的选择。分别称取经预处理不同型号的聚酰胺各1 g于干净的250 ml锥形瓶中，向锥形瓶中加入 1 mg/ml样液20 ml，在120 r/min 20 ℃恒温振荡器中振荡吸附24 h，测定溶液中剩余总酚的浓度，计算被聚酰胺吸附的多酚吸附量；然后，将充分吸附后的聚酰胺浸泡于80 ml浓度85%乙醇溶液中，于120 r/min 20 ℃恒温振荡器中振荡洗脱24 h，测定乙醇溶液中多酚浓度，计算乙醇洗脱率；将洗脱液烘干后复溶，测定其纯度。

（2）吸附时间。分别称取30～60目聚酰胺1 g于干净的250 ml锥形瓶中，向锥形瓶中加入 1 mg/ml样液20 ml，在120 r/min 20 ℃恒温振荡器中振蕩吸附。每隔30 min测定溶液中剩余总酚浓度，计算被聚酰胺吸附的多酚的吸附量。以时间为横轴，以聚酰胺吸附量为纵轴，绘制聚酰胺吸附多酚的静态吸附曲线。

（3）上样pH。称取30～60目聚酰胺1 g于250 ml锥形瓶中，分别加入1 mg/ml pH为3、4、5、6、7样液20 ml，于120 r/min 20 ℃恒温振荡器中振荡吸附24 h，测定溶液中剩余总酚的浓度，计算聚酰胺的吸附量。以pH为横轴，以聚酰胺吸附量为纵轴，绘制聚酰胺对不同pH的红松多酚静态吸附曲线。

N=（C₀-C₁）×V/M

式中，N为吸附量（mg/g）；

C₁为吸附后多酚浓度（mg/ml）；

C₀为吸附前多酚浓度（mg/ml）；

V为供试液体积（ml）；

M为聚酰胺质量（g）。

（4）洗脱液的选择。分别称取30～60目聚酰胺1 g于干净的250 ml锥形瓶中，加入1 mg/ml样液20 ml，于120 r/min 20 ℃恒温振荡器中振荡吸附24 h，测定溶液中剩余总酚的浓度，用蒸馏水冲洗过滤后，将充分吸附多酚样液的聚酰胺树脂分别浸泡于不同浓度梯度的乙醇、甲醇、丙酮中，于120 r/min 20 ℃恒温振荡器振荡24 h，测定洗脱溶液中多酚的浓度，计算洗脱率；将洗脱液烘干后复溶，测定其纯度。

1.2.3.2

二次纯化动态试验。

（1）洗脱液用量。将浓度为1 mg/ml的一次纯化液2 BV，以1 ml/min流速上样，吸附1 h后，用蒸馏水除杂，分别用1、2、3、4、5 BV（聚酰胺填柱量）pH 7浓度70%乙醇溶液以（0.4±0.2）ml/min的流速洗脱，收集洗脱液，计算在不同体积乙醇洗脱下多酚洗脱率、纯度，并且绘制洗脱曲线、纯度曲线。

D=M₁/（M₂-M₃）×100%

式中，D为洗脱率（%）；

M₁为解吸液中多酚含量（mg）；

M₂为吸附前样品中多酚含量（mg）；

M₃为吸附后样品中多酚含量（mg）。

P=（M₁/M₂）×100%

式中，P为红松多酚纯度（%）；

M₁为洗脱液中多酚含量（mg）；

M₂为洗脱物干重（mg）。

（2）上样量。分别吸取浓度为1 mg/ml一次纯化液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 BV（聚酰胺填料量）以（1.0±0.2）ml/min进行吸附。检测漏出液中多酚含量，漏出液多酚浓度达上柱浓度的10%（达到泄露点）停止上柱，考察上柱量对聚酰胺吸附一次纯化后红松多酚的影响，绘制动态吸附曲线。

（3）洗脱浓度。将浓度为1 mg/ml的一次纯化液2 BV以1 ml/min进行吸附，吸附1 h后，用蒸馏除杂，分别用浓度40%、50%、60%、70%、80%pH为7的乙醇溶液以（0.4±0.2） ml/min的流速洗脱，收集洗脱液，计算在不同浓度乙醇洗脱下的多酚洗脱率、纯度，并且绘制洗脱曲线、纯度曲线。

（4）洗脱液pH。将浓度为1 mg/ml的一次纯化液2 BV以1 ml/min上样，吸附1 h后，用蒸馏水除质，分别用pH为6、7、8、9、10 的浓度70%乙醇溶液以（0.4±0.2） ml/min的流速洗脱，收集洗脱液，计算在不同pH乙醇洗脱下多酚洗脱率、纯度，并且绘制洗脱曲线、纯度曲线。

1.2.3.3

二次纯化最优条件的确定。通过以上的静态、动态的单因素试验，确定红松多酚二次纯化的最优吸附时间、上样pH、洗脱液的用量、上样量、洗脱液浓度、洗脱液pH，以此为基础，选取上样量、洗脱液浓度及洗脱液pH 3个因素，通过L₉（34）正交试验设计优化红松多酚二次纯化工艺条件。

1.2.4

红松种鳞多酚抗氧化研究。

1.2.4.1

清除DPPH·试验。以VC作为阳性对照，1 ml蒸馏水与3 ml无水乙醇混合液为空白对照。制备 0.10 mmol/L DPPH·无水乙醇溶液，取3 ml DPPH·溶液，加入1 ml不同浓度多酚样液，室温下反应30 min后在519 nm处测吸光度，读数为A₁；取3 ml无水乙醇溶液，加入1 ml多酚样液，室温下在519 nm处测吸光值，读数为A₂；取3.00 ml DPPH·溶液，加入1 ml无水乙醇，在519 nm处测吸光度，读数为A₀。

DPPH·清除率=1-

1.2.4.2

总还原力的测定。以VC作为阳性对照，取不同浓度样品的溶液1 ml，立即加入1 ml 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6）和1 ml浓度1%铁氰化钾。将混合物放置在50 ℃的水浴锅中保温20 min，添加1 ml浓度10%三氯乙酸，将混合物在室温下3 500 r/min离心10 min，吸取1 ml上清液，加入6 ml蒸馏水和0.5 ml浓度0.1%三氯化铁，混匀后反应10 min。用分光光度计在700 nm下测得反应物的吸光值，空白以蒸馏水代替样液。吸光值和还原能力呈正比。以吸光值为结果，比较还原能力。

2 结果与分析

2.1 红松种鳞多酚二次纯化工艺条件的优化

2.1.1

红松种鳞多酚二次纯化静态试验。

2.1.1.1

不同型号聚酰胺树脂的筛选。由表1可知，随着聚酰胺目数的增大，吸附量增大，而洗脱率、纯度则反之。这是由于随着聚酰胺目数的增大，其与料液接触的面积也相应增加，因此其吸附量呈上升趋势；但是，由于目数越大，单个聚酰胺分子对多酚的吸附就越紧密，导致洗脱较困难，且目数较大的聚酰胺中含有较细的聚酰胺粉末，易随洗脱液一同流出，影响多酚的纯度；目数越大的聚酰胺树脂越难进行预处理。因此，综合考虑，应选30～60目聚酰胺作为该次试验的柱层析树脂。

2.1.1.2

吸附时间对多酚吸附量的影响。 通过聚酰胺静态吸附试验，每半个小时测定一次多酚含量，得出吸附时间与多酚吸附量的关系。由图1可知，随着时间的增加，聚酰胺对一次纯化液的吸附量也增加，且吸附速率较快，当吸附时间为1.5 h时达到吸附饱和。考虑到缩短吸附时间有利于缩短工业生产周期、提高生产效率，且1.0、1.5 h的吸附量相差不大，在进行柱层析时选择1.0 h为最佳吸附时间。该结果与吴新荣等^[8]在聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮研究中对静态吸附时间的试验结果相符合，其试验的最佳吸附时间为1～2 h。

化学合成药的分离纯化成本一般是合成反应成本费用的1～2倍，且不同的分离提取方法对多酚的有效成分的影响不同。由此可见，分离提取是产品生产合格的重要保障。因此，研究和改善分离提取方法，对于产品质量的提高及发挥具有相当重要的作用。

该研究以AB8大孔吸附树脂将红松种鳞多酚提取物进行一次纯化后，采用聚酰胺以层析柱法，对红松种鳞多酚的一次纯化物进行二次纯化，分别考察聚酰胺树脂型号、上样pH、吸附时间、洗脱液、上样量、洗脱浓度、洗脱pH对纯化效果的影响。通过正交试验优化二次纯化的工艺条件，得到的最佳工艺条件为：聚酰胺树脂型号为30～60目、上样pH 5、吸附时间1 h、洗脱液为乙醇、上样量2 BV、解吸浓度70%、解吸pH 7。试验结果表明，聚酰胺柱层析对多酚的二次纯化具有显著的效果，可使纯度由粗提时的12%±3%提高到62%±2%，为多酚单体的获得奠定基础，同时为抗氧化产品的开发提供较优原料。

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