少突胶质前体细胞缺血缺氧损伤模型的建立

吴锡艳 何扬涛

【摘 要】 目的：建立少突胶质前体细胞缺血缺氧脑白质损伤模型。 方法：将大鼠少突胶质前体细胞分为正常对照组和缺氧缺糖组，正常对照组细胞用DMEM-F12培养基培养，不做缺氧缺糖处理，缺氧缺糖组细胞用无糖DMEM和Na2S2O4处理，Na2S2O4终浓度为10mmol/L。取处理后10min、30min、60min和90min为观察点，进行形态学观察和MTT测定。结果：与对照组相比，缺氧缺糖组OPCs形态随缺氧缺糖时间的延长而发生明显改变，细胞存活率降低。讨论：联合应用无糖培养基和连二亚硫酸钠可以在常氧培养条件下建立少突胶质前体细胞缺氧缺糖模型。

【关键词】 少突胶质前体细胞 缺血缺氧模型 建立

【中图分类号】 R722.6 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-8801（2014）03-0388-01

目前，脑白质损伤已成为早产儿脑损伤的重要形式。研究表明，缺氧缺血（HI）、感染和免疫损伤等多种因素均可以导致新生儿脑白质损伤的发生[1]。尤其是缺氧缺血，这与脑白质的主要细胞成分-少突胶质细胞有关[3]。不同发育阶段的少突胶质细胞对缺氧缺血的耐受性不同，晚期少突胶质祖细胞和未成熟少突胶质细胞最为易损，成熟少突胶质细胞最为耐受。由于神经胶质中少突胶质细胞发育最晚，在胎龄24周左右才逐渐由其前体细胞向成熟少突胶质细胞转化，因此，早产儿的胎龄越小，其脑白质中少突胶质的前体细胞含量越多，就越容易发生脑白质损伤。而目前对新生儿缺血缺氧性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的治疗仅局限于支持疗法，尚无促进神经再生的手段[7]。探讨缺血缺氧脑白质损伤发生的特点和机制己成为迫切的需要，寻求简单可行的方法建立缺血缺氧脑白质损伤模型，则有助于深入了解缺血缺氧引起少突胶质前体细胞损伤的机制，同时也能够为探寻有效的干预、治疗措施提供平台。

1 OPCs的培养

按照本实验室牛建钦的“少突胶质前体细胞的分离纯化方法”[12]培养OPCs。

2 少突胶质前体细胞缺氧缺糖离体模型的建立

取纯化培养2天，经鉴定为PDGFαR阳性的大鼠少突胶质前体细胞制作缺氧缺糖模型。将大鼠少突胶质前体细胞分为正常对照组和缺氧缺糖组，正常对照组细胞用DMEM-F12培养基培养，不做缺氧缺糖处理，缺氧缺糖组细胞用无糖DMEM和Na2S2O4处理，Na2S2O4终浓度为10mmol/L。取处理后10min、30min、60min和90min为观察点。进行形態学观察和MTT的测定。

3 结果

3.1 倒置相差显微镜下观察少突胶质前体细胞的形态变化

缺氧缺糖组OPCs形态随缺氧缺糖时间的延长而发生明显改变。缺氧缺糖10分钟时，细胞仍贴壁生长，细胞折光性无明显改变，部分突起出现轻度肿胀，呈节段样或“串珠样”改变，胞体肿胀尚不明显。缺氧缺糖30分钟，少量细胞不能贴壁而开始漂浮，贴壁细胞折光性减弱，胞体轻度肿胀，细胞突起节段样或“串珠样”改变更加明显，部分突起回缩。缺氧缺糖60分钟，漂浮细胞增加，贴壁细胞明显肿胀、胞体混浊，细胞突起多数节段性肿胀明显，可见较多突起断裂。缺氧缺糖90分钟，大部分细胞漂浮，剩余细胞多数胞体极度肿胀，胞质内可见大小不等的空泡，细胞核不清，突起断裂，可见较多细胞已经崩解。

3.2 MTT法（四哇氮盐比色实验）测定少突胶质前体细胞存活率

结果显示，在缺氧缺糖早期，缺氧缺糖组细胞存活率较正常对照组已有降低，但尚无统计学意义（P>0.05）；随着缺氧缺糖时间的延长，细胞存活率逐渐降低，60min时，细胞存活率已降到接近50%，到90min时，已剩下不到一半细胞存活，与对照组相比，差异均有显著性（P<0.05）（表1）

4 讨论

本实验中，在缺氧缺糖后开始后，细胞很快就出现形态学上面的改变，随着缺氧缺糖时间的延长，细胞开始出现水肿、细胞活力明显减退，细胞突起水肿、断裂，直至最后多数细胞漂浮，细胞极度肿胀乃至崩解。MTT法检测也提示细胞存活率随着时间的延长逐渐降低，至60分钟时已降至正常的一半左右，90分钟时则已降至正常的一半以下，说明连二亚硫酸钠和无糖培养基的联合应用使少突胶质细胞在较短的时间内即出现了缺氧性损伤和丢失，可以模拟严重脑白质损伤的细胞改变情形。但由于缺氧缺糖至90分钟时，大部分细胞己经死亡和丢失，不利于后续的实验研究，故选用存活细胞大约有50%的60分钟来作为终止缺氧缺糖的时间。

参考文献

[1]Michael V， Johnston， William H， et al. Neurobiology of Hypoxic-Ischemic Injury in the Developing Brain. Pediatric Research， 2001， 49（6）： 735-741.

[2]Volpe JJ. Hypoxic-ischemic encephalopathy. Neurology of the Newborn， 4th edi. Philadelphia： W.B. Saunders company， 2001， 217.

[3]Snyder EY， Wolfe JH. Central nervouse system cell tansplantation： a novel therapy for storage diseases？ Curr Opin Neurol， 1996， 9（2）： 126-136.

[4]牛建钦，肖岚.P.少突胶质前体细胞的分离纯化方法.2011，7.