苦参碱对早幼粒白血病HL-60细胞凋亡的影响

江梅 宋庆林

【摘 要】目的：探讨苦参碱对ＨＬ-60白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法：运用ＭＴＴ法和流式细胞术检测苦参碱对ＨＬ-60白血病细胞的增殖抑制及促凋亡作用, 应用实时定量PCR技术检测Ｂｃｌ-2蛋白的表达。结果：随着苦参碱浓度的升高, 各项指标与对照组相比较的差异均有统计学意义(Ｐ<0.01);ＨＬ-60细胞增殖明显受到抑制;细胞凋亡率明显增加, 且当苦参碱浓度为2.0mg/ml时, 细胞凋亡率达65.84%;2.0mg/ml苦参碱作用72ｈ后的细胞, ｂｃｌ-2蛋白的表达较对照组显著减少。结论：苦参碱具有对ＨＬ60白血病细胞增殖抑制及促凋亡作用, ｂｃｌ-2蛋白表达下调在此过程中可能发挥着重要的作用。

【关键词】苦参碱；ＨＬ-60细胞；ｃｌ-2蛋白

【文章编号】1004-7484（2014）03-01099-01

苦参碱（Mat）是传统中药苦参的有效成分，研究报道苦参碱类药具有显著抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤分化和凋亡、抗肿瘤浸润和远处转移、抑制肿瘤新生血管形成、减轻肿瘤炎症和抑制肿瘤耐药性、减低化疗不良作用、增强肿瘤宿主免疫等功能［1］。本实验观察苦参碱对HL一60细胞增殖与分化方面的影响，并对其作用机制进行初步探讨，以期对白血病的治疗提供参考。国内研究发现苦参煎液对人早幼粒白血病细胞有诱导分化作用[2]；近几年有人研究了苦参碱对K562细胞诱导分化作用、苦参抗人急性髓系自血病HL一60细胞作用[3~5]本实验采用苦参碱干预处理人急性早幼粒白血病HL一60细胞，进一步证实其对HL一60细胞的增殖抑制和促进诱导凋亡作用，并观察苦参碱诱导HL一60细胞凋亡时Bcl一2基因表达变化并探讨凋亡发生的机制。为开发新的抗肿瘤药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 苦参碱购自百灵威科技，货号KS-5203，经HPLC法鉴定纯度＞98%。阳性药物顺铂购自江苏豪森药业股份有限公司（国药准字H20040813）。

1.2 细胞株 人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60来自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.3 试剂 RPMI1640培养液及四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购自美国GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青生物有限公司；

1.4方法 细胞培养：HL-60细胞为悬浮生长的细胞，用含有10%小牛血清RPMI-1640培养基中，37.5℃、5%CO2饱和湿度条件下常规培养。每2 d换液传代，实验选用对数生长期细胞。

1.4.1 实验分组 实验分为阴性对照组，实验组（苦参碱低、中、高浓度组：0.5、1、2 mg/ml），顺铂阳性对照组（0.01 mg/ml）。

1.4.2 MTT比色法观察药物对细胞生长的影响 取处于对数生长期HL-60细胞，调整细胞浓度为2×105 /ml，接种于96孔培养板内。各苦参碱处理组给予相应浓度苦参碱，阳性对照组给予顺铂0.01 mg/ml，对照组给予与最高给药浓度组等量的药物溶媒。每个剂量设6个平行孔，重复3次。在37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，每孔加入MTT继续培养4 h，离心后吸去上清，加入DMSO显色，避光平行振荡10 min，在酶标仪上测定波长为490 nm处的吸光度，计算生长抑制率（%）=1－实验孔OD值/对照组OD值。

1.4.3流式细胞术检测苦参碱诱导ＨＬ60细胞的凋亡率以0.5、1.0、2.0mg/mＬ浓度的苦参碱作用72ｈ后分别收集ＨＬ60细胞。按照试剂盒说明操作, ＰＢＳ洗涤2次, 用结合缓冲液将细胞浓度调整为1×106/ml，取100ml加5ulAnnexin -V和10ulPI溶液，混匀。室温避光孵育15分钟后加入400ul缓冲液，上机检测。

1.4.4凋亡相关基因Bcl-2的mRNA表达检测 根据NCBI Gene banck中cDNA序列，按照互補原则，兼并Tm值、C+G含量等因素进行引物设计：

Bcl-2： 上游引物：5'- TGT GTG GAG AGC GTC AAA CC-3'；

下游引物：5'- TGG ATC CAG GTG TGC AGG T-3'；

根据上述引物，采用北京全式金实时定量RT-PCR试剂盒检测Bcl-2的 mRNA表达。

2 结果：

2.1 苦参碱对HL-60细胞生长抑制率的影响

对照组HL-60细胞生长活跃，而各剂量苦参碱处理组HL-60细胞生长相对缓慢。经MTT比色法测定得出，0.5 mg/ml组、1 mg/ml组和2 mg/ml组测得的吸光度均较对照组显著降低（P<0.01），表示苦参碱可显著抑制HL-60细胞的增殖。不同浓度苦参碱对ＨＬ60白血病细胞增殖有抑制作用, 而且这种作用呈时间-剂量依赖关系,随着苦参碱浓度增加或作用时间延长，ＨＬ60白血病细胞增殖抑制率增加, 详见表1、表2

2.2苦参碱对HL-60细胞凋亡的影响：

ＨＬ60细胞经0.5、1.0、2.0mg/ml的苦参碱分别作用24、48、72ｈ后, 用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示:在一定的浓度范围内(0.5～2.0mg/ml)苦参碱诱导ＨＬ60细胞凋亡的作用随着苦参碱浓度的增加而增强, 具有浓度依赖性;随着作用的时间延长苦参碱的诱导凋亡作用也增强, 差异有统计学意义(Ｐ<0.01)见表3。结果提示:一定浓度范围内(0.5～2.0mg/ml)苦参碱诱导细胞凋亡作用呈时间-剂量依赖关系。

Annexin -V FITC/PI双染法FCM检测显示，不同浓度苦参碱作用48h对HL-60细胞凋亡利率Annexin -V（+）/PI(-）的影响（n=5)见表3。如表3所示，不同浓度苦参碱作用后，细胞凋亡率明显高于空白对照组（p<0.01)，且随浓度的增加凋亡率从47.83%增加到65.84%。

为进一步检测苦参碱促进HL-60细胞凋亡的可能機制，本研究利用实时定量RT-PCR法检测了凋亡相关基因Bcl-2的mRNA表达。如表4所示，苦参碱0.5 mg/ml组对Bcl-2基因的表达无显著影响。苦参碱2.0 mg/ml组对Bcl-2基因具有显著的抑制作用（P<0.01）。

3 讨论：

苦参是我国传统的常用中医药，苦参碱是其主要的生物碱之一，已能提取和纯化，具有抑制肿瘤生长、抗感染等多种功能。白血病是一种常见的肿瘤性疾病，ALL是自血病中常见一种类型，在小儿尤其多见。目前主要采用化疗和骨髓移植，费用昂贵，且化疗副作用大，开发中药治疗是治疗白血病的一个方向。经MTT比色法测定得出，0.5 mg/ml组、1 mg/ml组和2 mg/ml组测得的吸光度均较对照组显著降低，表示苦参碱可显著抑制HL-60细胞的增殖。不同浓度苦参碱对ＨＬ60白血病细胞增殖有抑制作用, 而且这种作用呈时间-剂量依赖关系,随着苦参碱浓度增加或作用时间延长，ＨＬ60白血病细胞增殖抑制率增加, 见表1、表2。

本结果发现苦参碱对ALL细胞的增殖有抑制作用，苦参碱在相对低浓度下(0．5 mg／m1)对ALL细胞有诱导凋亡作用，但相对高浓度时的(2mg／m1)可见细胞抑制率明显增高。在一定的浓度范围内(0.5～2.0mg/ml)苦参碱诱导ＨＬ60细胞凋亡的作用随着苦参碱浓度的增加而增强, 具有浓度依赖性;随着作用的时间延长苦参碱的诱导凋亡作用也增强, 差异有统计学意义(Ｐ<0.01)见表3。结果提示:一定浓度范围内(0.5～2.0mg/ml)苦参碱诱导细胞凋亡作用呈时间-剂量依赖关系。现已证明，细胞凋亡调控蛋白与白血病发生、发展有密切关系。近年研究表明Bcl一2参与了细胞诱导、分化、凋亡的调控，Bcl一2家族成员在内源性凋亡途径(线粒体途径)中起着重要作用。Bcl一2家族成员包括抑制凋亡的基因和促凋亡基因，本实验通过RT—PCR检测发现，苦参碱在0.5—1.0mg／mL浓范围内，随着苦参碱浓度的增加，Bcl一2的表达逐渐减少，与苦参碱的浓度呈反比关系。说明苦参碱诱导细胞凋亡的过程中，抑凋亡基因Bcl一2表达减少，同时也表明Bcl一2基因在苦参碱诱导细胞凋亡中起着一定的调控作用。

研究发现一定浓度苦参碱作用ALL细胞可引起生长抑制，具有一定的凋亡诱导作用。利用实时定量RT-PCR法检测了凋亡相关基因Bcl-2的mRNA表达。如表4所示，苦参碱0.5 mg/ml组对上述基因的表达无显著影响。对抑凋亡基因Bcl-2具有显著的抑制作用（P<0.05或P<0.01）RT-PCR法检测发现苦参碱作用后的ALL细胞Bd一2阳性率呈明显的下降趋势，苦参碱可下调ALL细胞Bcl．2表达，推测苦参碱对ALL细胞生长抑制作用可能与其下调ALL细胞Bcl一2基因表达有关，进一步研究其机制，开发并把苦参碱应用于临床将具有重要意义。

已有研究证实，苦参碱对白血病细胞的增殖具有明显的抑制作用，能促进白血病细胞凋亡，并能诱导白血病细胞从功能上向成熟细胞分化。说明苦参碱具有抗白血病的作用，可能是通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡实现的。至于苦参碱对HL-60细胞抑制增殖和诱导分化作用的具体机制还需要我们进一步的探索。

参考文献：

[1] 张鸣杰，黄摇 建援 苦参碱类抗肿瘤作用机制研究的新进展［J］援 中国中药杂志，2004,29 （2）；115

[2] 徐建国，马俊荣，杨贵生，任连生，郭亚东，张鸿翔．苦参煎液对人早幼粒自血病细胞的诱导分化研究[J]．中国中药杂志，1990，15(10)：49—50．

[3] 张彦，蒋纪恺，刘小珊。刘百忠，许湘儒，何渝军，等．苦参碱诱导K562白血病细胞分化和凋亡的实验研究[J]．癌症，2000，19(8)：756—758．

[4] 张莉萍，蒋纪恺，谭荣安，刘小珊，张彦，许湘儒，等．苦参碱对K562细胞株端粒酶活 性和细胞周期的影响[J]．中华肿瘤杂志，1998，20(5)：328—329．

[5] 谭孟群，罗志勇，王绮如，蒋德昭．苦参抗自血病作用及其机制[J]．湖南医科大学学报，2000，25(5)：443—445．