三丁基氯化锡对僧帽牡蛎抗氧化酶活性的影响

陈细香　吴文杰　陈小青　柯江波

摘要[目的] 探讨三丁基氯化锡（TBTCl）对僧帽牡蛎抗氧化酶系统毒性的影响程度及致毒机制。[方法] 在实验室条件下，研究不同浓度（1、2、5、10和100 ng/L）的三丁基氯化锡（TBTCl）在不同暴露时间（24、72、96 h）对僧帽牡蛎消化腺和鳃的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和硒依赖谷胱甘肽过氧化酶（SeGPx）活性的影响。[结果] 当TBTCl浓度为1和2 ng/L时，在整个实验期间TBTCl对消化腺和鳃内SOD和SeGPx活性无显著影响（P>0.05），而对消化腺CAT活性有显著诱导作用（P<0.05）。当TBTCl浓度为5 ～100 ng/L时，SOD、CAT和SeGPx的活性都呈现不同程度的时间剂量依赖关系。[结论] 该研究可为餐桌食品污染的防患、无公害水产品的生产和环境检测提供科学依据。

关键词三丁基氯化锡；僧帽牡蛎；消化腺；鳃；SOD；CAT；Se–GPx

中图分类号S985.3+5文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01075-04

基金项目福建省科技厅青年科技人才创新项目（2008F3095）；福建省高校服务海西建设重点项目（A102）；硕士学位授予单位立项建设学科（生物学）。

作者简介陈细香（1972- ），女，福建莆田人，副教授，博士，从事环境生态学研究。

有机锡化合物对海洋生物的影响越来越引起人们的广泛关注[1-2] 。生物体内积累有机锡，以毒性最强的三丁基氯化锡（Tributyltin chloride，TBTCl）浓度最高。由于有機锡在海洋环境中的长期残留，即使在停止使用相当长时间后，海水和底泥中仍会存在三丁基氯化锡（TBTCl）[3] 。我国污染海域中有机锡质量浓度从几ng/L 到几百ng/L不等[4]。江桂斌等[5]通过对我国沿海和内陆水域地区的采样测定，发现所有采样点都存在有机锡的污染情况。Zhou 等[6]对我国7个城市采集的海产品进行了测定，均发现了TBTCl的存在，即使经蒸煮烹调后TBTCl仍然存在。

三丁基氯化锡（TBTCl）的重要用途之一就是用于船体涂层添加物以防止粘附生物的增长，但同时也对牡蛎等非目标生物构成威胁[7-9] 。笔者研究三丁基氯化锡（TBTCl）对僧帽牡蛎（Ostrea cucullata）的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、硒依赖谷胱甘肽过氧化酶（SeGPx）活性的影响，旨在探究TBTCl对僧帽牡蛎抗氧化酶系统毒性的影响及致毒机制，以期为餐桌食品污染的防患、无公害水产品的生产、环境检测提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1僧帽牡蛎。试验选用健康牡蛎，购自泉州浔埔海鲜世界大型超市，体重25.69～38.12 g，贝高2.29～2.78 cm，贝宽4.13～4.86 cm，贝长6.29～7.34 cm。试验前将购买回来的牡蛎清除附着物，先在实验室内暂养7 d，暂养期间12 h换水1次，并一次性充氧30 min。试验前选择健康、反应灵敏、大小基本一致的僧帽牡蛎随机分组。试验期间不投喂饵料。

1.1.2试剂。牛血清白蛋白（上海生工生物工程有限公司产品）、考马斯亮蓝G250（Fluka 产品）、邻苯三酚（AR）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，AR）、盐酸、85%磷酸、Na2HPO4·2H2O（AR）、KH2PO4（AR）、蒸馏水等。三丁基氯化锡（TBTCl），用无水乙醇溶解定容，配制母液10 μg/L，备用。实验时，对照浓度组为含0.05 ml/L乙醇的水体。

1.2试验方法

1.2.1染毒处理。根据环境部门规定的允许浓度[10]及污染海域环境中有机锡质量浓度[4]，设置对照组和5个浓度梯度试验组（1、2、5、10和100 ng/L），并且分别做3组平行试验。每个不锈钢盆中放置30只僧帽牡蛎，充气，记录每组牡蛎的分泌物变化、活动状态，并及时捞出死亡牡蛎。每日更换相同浓度的污染液，试验期间水温23～25 ℃，pH为7.8～7.9，盐度为32‰～34‰。分别在染毒24、72和96 h 后取样。

1.2.2粗酶液的提取。从各染毒组中分别随机取出牡蛎样品6只，去掉外壳取出软组织，用蒸馏水冲洗其软体组织数次，并用滤纸拭干后称重、冰浴下快速活体解剖，分别取出消化腺和鳃，以8倍体积磷酸缓冲液冰浴匀浆，4 ℃离心（12 000 r/min，30 min），将上清液置于-80 ℃冰箱中保存，待测。

1.2.3测定指标和测定方法。粗酶提取液中蛋白质含量采用考马斯亮蓝法[11]测定，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD含量[12]，采用紫外分光光度法测定CAT活性[13]，采用荧光分光光度法测定SeGPx活性[ 14]。

1.3数据处理结果均以平均值±标准误（Mean±S.E.）表示。采用方差分析方法分析三丁基氯化锡（TBTCl）污染引起的差异；采用Duncuns 法对组间数据进行差异性显著分析。使用SPSS 13.0 统计软件进行数据统计与分析，使用OriginPro 7.5绘图。

2结果与分析

2.1三丁基氯化锡（TBTCl）对僧帽牡蛎SOD活性的影响从图1可以看出，在消化腺中SOD的活性与TBTCl浓度和暴污时间存在一定的时间剂量效应关系。在对照组中，SOD的活性在整个试验周期几乎没有变化。从整体趋势上看，在1～100 ng/L TBTCl的胁迫范围内，僧帽牡蛎消化腺SOD活性随胁迫浓度的增大呈现出不同的变化趋势：在24 h内，僧帽牡蛎经低浓度（1 ng/L）的TBTCl胁迫，立即表现出诱导作用；当TBTC1浓度为5 ng/L时，出现并不明显的抑制作用，而当染毒物浓度达到10 ng/L时，抑制作用达到显著差异（P<0.05），当TBTC1浓度为100 ng/L时仍为显著抑制作用，抑制率达44.8%。在72 h内，变化趋势与24 h类似，而当TBTC1浓度到达5 ng/L时，僧帽牡蛎消化腺SOD活性回升，仍为抑制作用，但差异不显著（P>0.05）；在100 ng/L高浓度TBTCl的胁迫下，SOD活性回复至对照组水平（P>0.05）。在96 h内，低浓度TBTCl（1和2 ng/L）的胁迫下，僧帽牡蛎消化腺SOD活性受到诱导或抑制，差异不显著（P>0.05），当TBTC1浓度为5 ng/L时表现为显著抑制作用（P<0.05）。在10和100 ng/L浓度的TBTCl胁迫下，其活性回复并高于对照组，达到最大值[（54.73±0.31）U/mg]。

注：同一时间内不同小写字母表示各组间SOD活性差异显著（P<0.05）。

2.3三丁基氯化锡（TBTCl）对僧帽牡蛎SeGPx活性的影响从图3可以看出，处理24 h各浓度组下的SeGPx活性均有不同程度上升，但没有显著差异（P>0.05）。1 ng/L浓度组消化腺SeGPx活性在整个污染试验过程中基本与对照组一致。处理72 h，2和5 ng/L浓度组活性显著低于对照组（P<0.05），呈现抑制效应。10、100 ng/L浓度组活性都达到最大值（P<0.05），96 h后活性小幅度下降，时间-效应关系不显著（P>0.05）。消化腺SeGPx活性表现出随着三丁基氯化锡浓度的增加而增加的剂量一效应关系。

注：同一时间内不同小写字母表示各组间SeGPx活性差异显著（P<0.05）。

3讨论

3.1三丁基氯化锡（TBTCl）对僧帽牡蛎抗氧化酶活性的影响自McCord 和Fridovich 1969 年提出生物活性氧自由基伤害学说后，该学说被广泛运用于生物在环境胁迫下损伤机制的研究中。在正常条件下生物体内氧自由基的产生和清除处于一种动态平衡中，生理浓度的氧自由基不仅不会危害生物体，反而能起到一些独特的生理作用。在某些条件（如环境理化条件变化、病害、环境污染等），生物体中自由基可大量生成，对机体造成氧化损伤。生物体中存在用于清除自由基的抗氧化系统，由抗氧化酶和小分子抗氧化物组成。SOD、CAT和SeGPx 是生物体中最主要的3种抗氧化酶。SOD 专一催化超氧阴离子，将其歧化为H2O2和O2，H2O2可被CAT 和 SeGPx 进一步分解为H2O 和O2，从而阻止超氧阴离子转化为活性更高的·OH，·OH 能以接近扩散极限的速度与任何可氧化的分子发生反应。由于SOD、CAT和GPx在清除氧自由基中的重要作用，它们活性的高低可间接反映出生物体内氧自由基含量的变化。

有机锡TBTCl不是生物体的必需元素，对生物体完全无益，是有害金属，也是重要的环境和工业毒物，在一定浓度下，亦能产生毒害作用。当僧帽牡蛎处于低浓度TBTCl（1 ng/L）时，SOD、CAT和SeGPx活性上升，说明低浓度的有机锡进入僧帽牡蛎体内，刺激机体产生自由基，从而开始诱导清除自由基的SOD、CAT和SeGPx的合成。当僧帽牡蛎受更高浓度的TBTCl污染时，SOD、CAT和GSHPx活性变化都呈现出不同程度的时间剂量依赖关系。

该试验结果表明，10 ng/L TBTCl的24 h胁迫下，消化腺中SOD和CAT活性被显著抑制（P<0.05），僧帽牡蛎消化腺中包含肝组织，而肝是许多内源性和外源性化合物代谢解毒的场所，而鳃是呼吸器官，几乎没有吞噬和解毒功能，因此鳃对TBTCl的敏感性比消化腺要低。随着TBTC1浓度的增大，诱导程度不同，可能是因为产生“毒物兴奋效应”，机体的应激系统和抗氧化防御系统能被全面激活，以清除过量的自由基，使机体免受氧化伤害，从而表现为SOD活力有不同程度的变化。张红霞等[15]在有机锡离子对日本蟳血淋巴抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）活力影响的研究表明，在低浓度有机锡离子TBTCl≤2 ng/L作用下，各处理组SOD 活力在试验时间内均呈激活状态，而高浓度处理组（TBTCl ≥5 ng/L）SOD 活力在暂时下降后逐渐升高，与72 h变化趋势一样。96 h内，在1～5 ng/L TBTCl低浓度的胁迫下，僧帽牡蛎SOD活性呈现先下降再显著下降趋势（P>0.05），表现为抑制作用，当在高浓度10～100 ng/L TBTC1胁迫下，进入体内的TBTCl 增多，产生了大量的活性自由基，诱导SOD 活性不断上升，且高于其他染毒组。

黄周英等[16]通过0.1、1和10 ng/L浓度三丁基锡（TBT）對文蛤鳃的抗氧化酶活性及脂质过氧化暴露试验发现，除高浓度TBT（10 ng/L）暴露在早期对CAT活性产生抑制外，TBT暴露对CAT活性的作用主要为诱导效应，环境水平的TBT暴露对文蛤产生明显的氧化胁迫。该试验结果表明24、72、96 h内不同浓度的三丁基氯化锡（TBTCl）胁迫下，除了10 ng/L三丁基氯化锡（TBTCl）中强度胁迫下，在24 h内消化腺CAT活性表现为显著抑制作用，72和96 h内消化腺CAT活性回复到与空白对照无显著差异的水平。三丁基氯化锡（TBTCl）处理僧帽牡蛎24 h 后，在10 ng/L浓度组与0 ng/L对照组CAT活性表现出显著抑制效应，随着暴露时间的延长，逐渐与0 ng/L对照组的CAT活性接近，出现这种效应可能是由于短时间的污染物暴露使酶蛋白的失活所致，此后机体的应激性恢复了CAT的代偿性机能。1、2、5和100 ng/L浓度的三丁基氯化锡（TBTCl）都对僧帽牡蛎消化腺CAT活性产生不同程度的诱导作用，均在100 ng/L三丁基氯化锡（TBTCl）下，活性最大。这说明在较低浓度的三丁基氯化锡（TBTCl）胁迫启动了机体的抗氧化酶系统，因此消化腺内的CAT活性升高。随着TBTC1浓度的增大，诱导程度不同，可能是因为产生“毒物兴奋效应”，机体的应激系统、抗氧化防御系统，能被全面激活，在自由基的诱导下，酶活力逐渐升高，以清除过量的自由基，使机体免受氧化伤害，从而表现为CAT活力有不同程度的升高[17]。随着染毒时间的延长，在100 ng/L高浓度下，由于僧帽牡蛎机体内CAT的代偿性机能恢复，僧帽牡蛎内活性氧产生和抗氧化系统的酶促反应对活性氧清除之间可能存在较好的动态平衡，因此在100 ng/L浓度组下CAT活性呈现诱导作用，并达到最高值。

SeGPx的主要功能在于催化过氧化氢和有机过氧化物，也能参与清除三丁基氯化锡代谢过程中产生的各类自由基。该试验结果表明，随着僧帽牡蛎体内三丁基氯化锡含量的提高，Se–GPx活性普遍增加。这表明有机锡污染程度的加剧已经引起氧化胁迫。SOD、CAT、SeGPx 在功能上是相关的[18]，但该试验研究结果没有发现三者活性的平行变化。考虑到生物体中由SOD 催化的超氧阴离子歧化并不是H2O2的唯一来源，还可以来自于氨基酸或细胞色素P450 氧化酶的反应，而SeGPx 的底物除了H2O2外还可以是有机过氧化物，SOD、CAT和SeGPx活性相关性不显著也是可能的。

3.2海洋生物體内有机锡的富集特点三丁基锡作为一种高效海洋杀生剂具有杀菌、杀微生物和杀虫性能，其重要用途之一是用于船体涂层添加物，以防止粘附生物的增长，但同时也对牡蛎等非目标生物构成威胁，能导致牡蛎生长畸形及繁殖力衰退等现象，曾引起世界许多地方的牡蛎养殖业蒙受巨大的损失。该试验表明，三丁基氯化锡浓度为2 ng/L时能对僧帽牡蛎淀粉酶和脂肪酶活性起到较强的刺激作用，且浮游生物对有机锡有明显的富集作用，港口附近的浮游生物体内有机锡浓度可达670～800 ng/g（干重）[19]，远高于环境浓度。软体动物体内能够累积较高浓度的有机锡。例如，贝类可以从环境中迅速吸收、富集有机锡。使体内浓度达到22 ng/g（湿重），高于环境5 000～60 000 倍[20]。鱼类体内同样能够累积有机锡。Rabitto等[21]研究表明石斑鱼在使用含有机锡饲料72 d后，体内有机锡含量达到0.3 μg/ml。鸟类和哺乳动物处于食物链的最顶端，体内有机锡的富集可以达到相当高的水平，海鸭肝脏中有机锡含量超过1 000 ng/g，宽吻海豚（Tursiops truncatus）肝脏中有机锡含量达到11 340 ng/g[19]。因此，必须加强养殖海区水质检测和管理。由于有机锡化合物会对环境产生较大影响，1974年联合国海洋污染防治公约就将有机锡列入优先控制的灰名单。英国政府也制定并从1987年开始执行有关限制有机锡使用的法规，有机锡环境质量标准从1986年20 ng/L提高为1988年的2 ng/L[22]。该试验结果表明TBTCl浓度为5 ng/L甚至1 ng/L时就会对僧帽牡蛎的抗氧化酶活性产生显著影响，因此限制有机锡的排放以及制定严格限量标准势在必行。

参考文献

[1] 李志斐，谢骏，龚望宝，等.三甲基氯化锡对水生生物的毒性效应[J].中国环境科学，2011，31（4）：642-646.

[2] 张亚莉，孙玉涛，翁登坡，等.三丁基锡对小鼠脾、肝和脑组织蛋白磷酸酶2A活性的影响[J].癌变·畸变·突变，2013，25（3）：194-197.

[3] 刘慧刚，徐立红.三丁基氯化锡毒性作用生物标记研究进展[J].中华预防医学杂志，2005，39（4）：288-289.

[4] JIANG G B，ZHOU Q F，LIU J Y，et al.Occurrence of butyltin compounds in the waters of selected lakes，rivers and coastal environments from China[J].Environmental Pollution，2001，115：81-87.

[5] 江桂斌，刘稷燕，周群芳，等.我国部分内陆水域有机锡污染现状初探[J].环境科学学报，2000，20（5）：636-638.

[6] ZHOU Q F，JIANG G B，LIU J Y.Smallscale survey on the contamination status of butyltin compounds in seafoods collected from seven Chinese cities[J].Agricultural Food Chemical，2001，49：4287-4291.

[7] 徐晓白，戴树桂，黄玉瑶.典型化学污染物在环境中的变化及生态效应[M].北京：科学出版社，1998：99-174.

[8] ALZIEU C.Environmental problems caused by TBT in France：assesment，regulations，prospects[J].Marine Environmental Research，1991，32：7-17.