氯氰菊酯对小鼠肾组织的氧化损伤

马 萍,张忠杰,焦 铭,廖文莉,陈姣娥,杨 旭,武 阳*(.湖北科技学院基础医学院,湖北 咸宁43700；.华中师范大学生命科学学院环境生物医学实验室,湖北 武汉 430079)

氯氰菊酯对小鼠肾组织的氧化损伤

马 萍1,2,张忠杰1,焦 铭1,廖文莉1,陈姣娥1,杨 旭2,武 阳1,2*(1.湖北科技学院基础医学院,湖北 咸宁437100；2.华中师范大学生命科学学院环境生物医学实验室,湖北 武汉 430079)

以昆明小鼠为受试动物,随机分为6组,包括1个阴性对照组、3个氯氰菊酯染毒组、1个维生素E组和1个高剂量氯氰菊酯加维生素E组,染毒组按10,20,40mg/kg水平,维生素E的剂量为100mg/kg,灌胃染毒小鼠7d.以肾组织匀浆测定活性氧(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量;以肾组织细胞测定DNA-蛋白质交联(DPC)系数.随着氯氰菊酯染毒剂量的升高,肾组织的ROS、MDA、8-OHdG含量和DPC系数逐渐上升,GSH含量逐渐降低,各指标呈一定的剂量-效应关系.染毒剂量为20mg/kg时,MDA和8-OHdG含量差异有统计学意义(P< 0.05);染毒剂量为40mg/kg时, ROS(F=3.7044)、GSH(F=3.4908)、MDA(F=3.5851)、8-OHdG含量(F=11.7934)和DPC系数(F=6.9165)差异均有统计学意义(P< 0.05, P< 0.01).病理学观察可见20,40mg/kg剂量组小鼠肾小球增生肥大,肾小管上皮细胞水肿,管腔变小.与高剂量染毒组相比较,高剂量染毒加维生素E组肾组织的ROS、MDA含量、8-OHdG含量和DPC系数均有下降,GSH含量上升(P< 0.05, P< 0.01).高剂量(≥20mg/kg)的氯氰菊酯能造成小鼠肾组织的氧化损伤,维生素E有抗氧化作用.

氯氰菊酯；维生素E；活性氧；还原型谷胱甘肽；丙二醛；8-羟基脱氧鸟苷；DNA-蛋白质交联；氧化损伤

拟除虫菊酯类农药是继有机磷、有机氯等农药之后发展起来的一类新型的杀虫剂,氯氰菊酯(cypermethrin, CP)是目前我国最常用的拟除虫菊酯类杀虫剂,CP以其高效低毒的显著特点广泛应用于农业、卫生、畜牧等各类害虫的防治.随着CP的大量使用,长期低浓度接触CP引发的人类健康问题日益受到人们的关注.对其毒性作用的研究表明,它对人和动物的神经系统、消化系统、血液系统、免疫系统和生殖系统都有不同程度损害[1-2].佟俊旺等[3]通过彗星实验证明当CP的染毒浓度达到80mg/kg时,能够导致小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤.李海峰等[4]和安丽等[5]分别以雄性家兔和雄性大鼠为试验对象,表明CP可导致动物睾丸结构损伤,精液活力下降[4-5].安丽等[6]还发现CP可致使小鼠体液免疫功能下降,其机制可能与脂质过氧化相关.崔永[7]研究发现CP可导致生殖细胞DNA链断裂,降低DNA甲基化水平,影响与生殖细胞发生和成熟有关基因的表达,影响动物的生殖和发育.邴欣等[8]发现CP可诱导雄性金鱼分泌卵黄原蛋白,且可使雄鱼生殖腺指数明显降低.本课题组先前的研究表明较高剂量的高效氯氰菊酯亦可造成小鼠肾脏的氧化损伤[9],但关于维生素E(VE)对CP导致肾组织氧化损伤的拮抗作用至今未见报道.本研究通过测定不同浓度CP作用下小鼠肾组织的ROS、GSH、MDA和8-OHdG含量、DPC系数的变化以及观察肾组织切片的生理病理变化,并同时加入VE保护,以探究CP对小鼠肾脏的氧化损伤及VE的抗氧化作用,以期为CP导致肾组织氧化损伤的发生机理及诊治提供某些科学依据.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Power wave XS酶标仪(美国Bio-Tek仪器有限公司), FLx 800荧光酶标仪(美国Bio-Tek仪器有限公司), F-4500型荧光分光光度计(日本日立公司), 5415R低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司),RM2245切片机(德国LEICA公司), HH-42三用电热恒温水箱(长源实验仪器厂,北京); DCFH-DA荧光染料(>99.9%,Sigma公司),蛋白酶K(Sigma公司),小鼠8-羟基脱氧鸟苷ELISA检测试剂盒(济南朋远生物技术有限公司),还原型谷胱甘肽试剂盒(南京建成生物工程研究所),Hoechst33258荧光染料(Sigma公司),三羟基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl,分析纯, Amresco分装),5,5’-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB,分析纯,国药集团化学试剂有限公司),硫代巴比妥酸(TBA,分析纯,国药集团化学试剂有限公司),VE (≥98%,上海楷洋生物技术有限公司).纯度为95% CP原药,由上海业联联合化工有限公司生产.

1.2 实验动物

选用湖北省实验动物研究中心提供的SPF级雄性昆明小鼠30只(合格证号:No. 42000600001226),体重为(30 ± 1.8) g,饲养1周后实验,实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2013-0071.实验过程中,小鼠饲养于无菌笼内,保持温度在20～25℃,笼内相对湿度为50%～70%,以商业鼠粮饲养小鼠,及时补充饮用水,并避免其接触其他干扰致病源,小鼠可自由进食进水.

1.3 动物分组和染毒

30只昆明小鼠随机分为5组,包括1个阴性对照组、3个CP染毒组和1个高剂量染毒加VE组,每组6只.阴性对照组用花生油;染毒组分为低、中、高剂量组,根据前期研究[10-11],确定CP染毒剂量分别为10,20,40mg/kg,以花生油稀释成1,2,4mg/mL 3种浓度的使用液;VE的剂量为100mg/kg.稀释液现用现配,使用时在旋涡混悬仪上充分混匀.均经口灌胃给予,灌胃量为10ml/kg,阴性对照组和染毒组每天1次,高剂量染毒加VE组上午给予染毒液,下午给VE,连续染毒7d,分别于实验前称小鼠体重.

1.4 肾组织切片的制备和观察

染毒结束后用颈椎脱臼法处死小鼠,立即取肾组织,肝组织用4%的多聚甲醛固定,常规脱水,石蜡切片,HE染色,普通光学显微镜下观察肾组织的病理组织学变化.

1.5 肾组织匀浆和细胞悬液的制备

将肾组织在冰冷的PBS(pH=7.5)中漂洗,滤纸拭干,分成两部分,一部分肾组织加PBS制成10%匀浆液,低温离心后取上清,用于ROS、GSH、MDA和8-OHdG的检测.另一部分肾组织剪成糜状,过滤后将细胞滤液离心去上清,再用 PBS重悬细胞,用于DPC系数的检测.

1.6 实验方法

1.6.1 ROS含量的测定 取上清液4µL,加入396µl PBS作100倍稀释.取100µL稀释液于酶标板中排列,并加入100µL荧光染料DCFA染色,避光反应5min,用荧光酶标仪检测.

1.6.2 蛋白质含量和GSH含量的测定 蛋白质含量按照Folin酚法测定,GSH含量的测定严格按照试剂盒操作说明进行.GSH含量(µmol/ gprot)=[(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)]×标准管浓度×样本稀释倍数÷待测匀浆蛋白浓度(gprot /L).

1.6.3 MDA含量的测定 取500µL上清液于试管中,并加入2mL 0.6%TBA,沸水浴15min.取上清1mL于EP管中,10000×g离心力离心5min.取上清100µL于酶标板中排列,用全波长酶标仪检测,分别在450nm、532nm和600nm波长下测定吸光值(以加PBS的为参照),按照公式MDA浓度(µmol/gprot)=[6.45(A532-A600)-0.56A450]÷待测匀浆蛋白浓度(gprot/L),式中,A为吸光度.

1.6.4 8-OHdG含量的测定 8-OHdG含量的测定严格按照试剂盒操作说明进行.以0,3,6,12, 24,48ng/mL等标准品浓度为横坐标,450nm 处OD值为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线来确定样品中8-OHdG的含量.

1.6.5 DPC系数的测定 采用KCl-SDS沉淀法进行检测[12].向样品中加入SDS,使之与 DPC及蛋白质结合,然后加入KCl溶液使DPC和蛋白质沉淀,而游离的DNA留在上清液中.将上清液转移后,再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白质,使DPC中的DNA游离出来,用荧光法测定此DNA的含量A(交联DNA)以及原液中DNA的含量B(游离DNA),计算DPC系数η[η=A/(A+B)].

1.7 统计分析

实验数据均采用χ±s表示.采用SPSS 12.0软件进行统计分析,多组间均数比较使用单因素方差分析(ANOVA),然后使用LSD检验比较两组间均数的差异性,统计检验水准α= 0.05.

2 结果

2.1 小鼠肾组织切片形态的变化

图1 不同处理组肾组织切片(×400)Fig.1 Kidney slices of different groups (×400)

从肾组织切片图1看到,空白对照组肾小球及肾小管结构正常;低剂量组(10mg/kg)小鼠肾脏的肾小管上皮细胞轻度水肿,管腔变小;中剂量组(20mg/kg)小鼠肾小球增生肥大,肾小管上皮细胞水肿明显,管腔变窄;高剂量组(40mg/kg)小鼠的肾小球明显增生肥大,可见球内毛细血管襻分叶;肾小管上皮细胞水肿,管腔变窄,甚至闭塞.结果表明,随着染毒剂量的加大,小鼠肾细胞的病理损伤越严重.CP+VE组小鼠的肾小管上皮细胞水肿明显,管腔变窄,病理损伤轻于高剂量组.

2.2 小鼠肾组织ROS含量的变化

不同处理组肾组织的ROS含量的变化见图2.ROS含量是反映机体氧化应激水平的指标,可以看出,随着染毒剂量的升高,ROS含量逐渐上升,呈一定的剂量-效应关系.与对照组比较,低、中剂量组(10,20mg/kg)差异无统计学意义,高低剂量组(40mg/kg)差异有统计学意义(P<0.05).以上结果表明,较高剂量的CP能造成ROS含量的上升.氯氰菊酯+VE组ROS含量低于CP高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05).

图2 不同处理组小鼠肾脏ROS含量Fig.2 ROS content in mouse kidney of different groups

2.3 小鼠肾组织GSH含量的变化

图3 不同处理组小鼠肾脏GSH含量Fig.3 GSH content in mouse kidney of different groups

GSH是GPχ(谷胱甘肽过氧化物酶)催化过氧化物还原的必需底物,故GSH含量也可反映机体抗氧化应激的水平,由图3可见,随着CP染毒剂量的升高,肾组织GSH含量逐渐下降,呈一定的剂量-效应关系.与对照组比较,低、中剂量组(10,20mg/kg)差异无统计学意义,高剂量组(40mg/kg)差异有统计学意义(P<0.05).以上结果表明,在较高剂量的CP作用下,小鼠肝的GSH含量下降明显.CP+VE组GSH含量高于CP高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05).

2.4 小鼠肾组织MDA含量的变化

由图4可见,与对照组比较,不同剂量的CP均能使小鼠肾MDA含量有不同程度的升高.低剂量组(10mg/kg)差异无统计学意义,中、高剂量组(20,40mg/kg)差异有统计学意义(P<0.05, P<0.01),这表明小鼠肾组织的脂膜已受到损伤. CP+VE组MDA含量低于CP高剂量组, 差异有统计学意义(P<0.05).

图4 不同处理组小鼠肾脏MDA含量Fig.4 MDA content in mouse kidney of different groups

2.5 小鼠肾组织8-OHdG含量的变化

由图5可见,与对照组比较,不同剂量的CP均能使小鼠肾8-OHdG含量有不同程度的升高.低剂量组(10mg/kg)差异无统计学意义,中、高剂量组(20,40mg/kg)差异有统计学意义(P<0.01),以上结果表明,在较高剂量的CP作用下,小鼠肾的8-OHdG含量升高明显.CP+VE组8-OHdG含量低于CP高剂量组,差异有统计学意义(P<0.01).

图5 不同处理组小鼠肾脏8-OHdG含量Fig.5 8-OHdG content in mouse kidney of different groups

图6 不同处理组小鼠肾脏DPC系数含量Fig.6 DPC coefficient in mouse kidney of different groups

2.6 小鼠肾脏DPC系数的变化

用KCl-SDS沉淀法检测DPC系数,其肾脏DPC系数变化如图6所示.随着CP染毒剂量的升高,DPC系数逐渐上升,呈一定的剂量-效应关系.低、中剂量组(10,20mg/kg)差异无统计学意义,高剂量组(40mg/kg)差异有统计学意义(P<0.01). CP+VE组DPC系数低于CP高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05).

3 讨论

拟除虫菊酯类杀虫剂在施用过程中效率高,用量低,无明显急性毒性作用.传统观点认为其在生物体内无蓄积效应,因而不会引起累积毒性效应.但随着此类农药的大量使用,其引起的亚急性和慢性毒性问题已受到学界和社会的广泛关注.而CP作为该类农药的典型代表,针对其毒性机制的研究是很有意义的.

肾脏组织切片结果显示:对小鼠口服染毒1周后,随着CP染毒剂量的升高,肾小管上皮细胞水肿程度逐渐加重,管腔逐渐变窄,肾小球逐渐肥大并且增生.说明CP可以引起肾组织病理性损伤,同时随着染毒剂量的加大,肾组织病理损伤愈发严重,具一定剂量-效应关系.这种趋势与CP致大鼠肾损伤的报道[13]一致.肾组织结构的病变同肾功能的下降有着必然的联系,在此病变过程中生化水平的变化起着重要的作用.在加入抗氧化剂VE后,发现肾组织的病理学损伤明显减轻,这暗示着氧化应激作用参与了肾组织的病变过程.

氧化损伤是多种疾病的重要发病机制,过量活性氧物质产生会导致机体产生氧化应激作用,直接或间接作用于胞内脂类、蛋白质及DNA等生物大分子,诱导改变它们的结构和功能,导致细胞死亡甚至组织损伤,最终使机体出现病变症状[14].机体的抗氧化系统能够保护机体免受活性氧等自由基的损伤,还原型的GSH可以和ROS结合形成硫代半缩醛,并通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环生成具更强抗氧化作用的抗坏血酸[15].本研究中,40mg/kg CP组小鼠肾组织ROS水平显著升高(P<0.05)、GSH含量显著下降(P<0.05),说明高剂量CP可以使机体活性氧过量产生,同时大量损耗GSH,破坏机体氧化/抗氧化平衡造成了氧化损伤,进而损伤细胞内生物大分子.

过量的ROS可以使脂质发生过氧化反应,脂质过氧化作用最大危害是它可以引发链式反应,将氧化作用放大化,即少量的活性氧可以导致大量脂类过氧化产物产生.MDA是脂质过氧化反应的主要性和标志性产物,其水平的高低代表脂质过氧化的强度[16].MDA化学形式活泼,可与蛋白质或核酸分子中的氨基反应形成复合物导致细胞的氧化损伤,改变细胞膜的结构,使膜成分之间形成交联和聚合,影响膜受体、膜离子通道的功能,甚至直接导致细胞死亡.在本研究中, 20mg/kg CP组MDA含量显著上升(P<0.05),说明较高浓度CP水平诱导小鼠肾细胞发生脂质过氧化反应,细胞膜结构发生损伤.

8-OHdG是活性氧基团引起的DNA氧化损伤修饰产物,是国际上公认的一种新型评价DNA氧化损伤和氧化应激状态敏感的生物标志物,测定机体8-OHdG含量对评估体内氧化损伤和修复程度有重要意义[17-18].ROS对细胞的氧化损伤作用还会引起DNA-蛋白质交联,DNA-蛋白质交联难以修复,增加染色体畸变和姊妹染色单体交换的发生率[19].在本研究中,40mg/kg CP组8-OHdG含量和DPC系数均显著上升(P<0.01),说明高浓度CP可以引起小鼠肾组织DNA碱基点突变和DNA-蛋白质交联物形成,对参与DNA复制、转录和修复相关蛋白活动可能起阻碍作用.

VE对机体的保护作用是通过VE作为电子供体存在于细胞表面,拦截具有强氧化能力的自由基,使细胞不被氧化而达到对细胞的保护作用.VE不仅本身具有抗氧化的能力,而且可以诱导机体提高超氧化物歧化酶(SOD)的作用,而SOD是氧自由基的主要清除剂,它能促使氧自由基的分解,并使自由基的形成和清除处于动态平衡,从而消除自由基对机体的危害[20].高剂量染毒加VE组与高剂量染毒组相比较,肾组织的ROS、MDA、8-OHdG的含量和DPC系数均有所下降,GSH含量上升,各指标差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01).说明VE的抗氧化作用显著,能够减轻CP对小鼠肾组织的氧化损伤.

4 结论

高浓度CP可使小鼠肾脏氧化应激/损伤生物标志物水平改变和组织损伤,导致肾脏毒性的发生,这种毒性作用可被VE所拮抗.表明氧化应激/损伤途径在CP致小鼠肾组织损伤中起介导作用.

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Oxidative damage induced by cypermethrin in the kidney tissue of Kunming mice.

MA Ping1,2, ZHANG Zhong-jie1,JIAO Ming1, LIAO Wen-li1, CHEN Jiao-e1, YANG Xu2, WU Yang1,2*(1.College of Basic Medical, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China；2.Laboratory of Environment Biomedicine, School of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2958～2963

Kunming mice were randomly grouped into six groups and treated with orally administered drugsona daily base for a week. The groups included one solvent control group, three cypermethrin groups, one high dose cypermethrin plus vitamin E protection group and one vitamin E group. The exposure doses of cypermethrin groups were 10, 20 and 40mg/kg respectively. Some kidney tissues were then made into homogenates for the measurement of reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH), 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) and malondialdehyde (MDA) contents. Meanwhile, DNA-protein crosslink (DPC) coefficients were detected from brain cell suspension.The kidney contents of ROS, MDA, 8-OHdG and DPC coefficients increased gradually in a dose-dependent manner, whereas GSH content decreased accordingly. In the exposure group with the dose of 20mg/kg, MDA contents and DPC coefficients were significantly higher than those of the control group (P<0.05); ROS (F=3.7044), GSH (F=3.4908), MDA (F=3.5851), 8-OhdG (F=11.7934) and DPC (F=6.9165) levels were significantly different in levels of each biomarker between 40mg/kg group and control group (P<0.05,P<0.01). Furthermore, the high-dosaged (20and 40mg/kg) group had increased glomerulus cells, proliferation and hypertrophy of glomerulus, hydrops of renal tubular epithelial cell, and narrow lumen. Administration of vitamin E (VE) to cypermethrin-treated mice reflected that ROS, MDA, 8-OHdG and DPC increased whereas GSH decreased (P<0.05,P<0.01). Cyermethrin at certain doses (≥20mg/kg) could induce oxidative stress in mice kidney, whereas vitamin E had antioxidant effects.

cypermethrin；vitamin E；reactive oxygen species；glutathione；malondialdehyde；8-hydroxy-2-deoxyguanosine；DNA-protein crosslinks；oxidative stress

X171.5

A

1000-6923(2014)11-2958-06

马 萍(1968-),女,湖北阳新人,教授,硕士,研究方向为环境毒理学.发表论文26篇.

2013-12-31

湖北省教育厅科学技术研究项目(D20122803);教育部国家级大学生创新训练计划项目(201210927036)

* 责任作者, 讲师, wysj2007@126.com